A unidade osso-músculo refere-se à interação mecânica entre o tecido ósseo e muscular e a intercomunicação através de fatores solúveis que regulam o metabolismo de ambos de forma recíproca. O sistema RANK-RANKL-OPG é classicamente descrito na ativação de osteoclastos, e RANKL e OPG são exemplos de osteocinas. Entretanto, a contribuição deste sistema na fibra muscular saudável ainda necessita de maiores elucidações. Recentemente, nosso grupo demonstrou o papel da sinalização RANK-RANKL no aumento do retículo mitocondrial, gasto energético e diferenciação de adipócitos bege. O tecido muscular esquelético apresenta altos níveis de expressão de RANK, que é fundamental para a regulação da atividade do retículo sarcoplasmático. Dessa forma, a hipótese deste trabalho é que a sinalização RANK-RANKL aumenta a biogênese mitocondrial e contribui para o a conversão das fibras para o perfil oxidativo. Os experimentos foram realizados em camundongos machos com 8 semanas de idade das linhagens C57BL/6J (selvagem), linhagem B6.129S4-Tnfrsf11b tm1Eac/J homozigoto knockout para proteína osteoprotegerina (OPG-/-) e heterozigotos para expressão de OPG (OPG+/-). Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FMRP/USP (CONCEA nº 0069/2020). A linhagem de mioblastos C2C12 diferenciada em miotubos foi utilizada nos ensaios in vitro. O sóleo de animais OPG-/- apresentou elevadas taxas de consumo de oxigênio quando comparado ao tecido de animais OPG+/- que, por sua vez, também apresentou valores maiores em relação ao selvagem, indicando o efeito do aumento de RANKL circulante na capacidade de respiração muscular. Miotubos da linhagem C2C12 estimulados com RANKL demonstram maior expressão de marcadores mitocondriais como ATP sintase, Citrato sintase, NRF-2, MFN-2 e OPA-1 quantificados por RT-qPCR, além de aumento do DNA mitocondrial, maior atividade de elementos responsivos a PPARs (PPRE) no ensaio de luciferase e aumento na marcação com Mitotracker®. O estímulo com RANKL induz a ativação das vias de sinalização ERK, p38 e CREB, que são associadas à adaptação metabólica, biogênese mitocondrial e metabolismo oxidativo. Miotubos estimulados com RANKL apresentaram maior capacidade respiratória de reserva (spare), sugerindo a potencial de adaptação dessas células ao aumento na demanda energética. A análise por RNA-Seq também demonstrou que miotubos estimulados com RANKL apresentam enriquecimento da via sinalização de ERK, assim como respostas envolvendo o remodelamento da matriz extracelular, homeostase da sinalização de cálcio e regulação de fatores de crescimento endotelial vascular, que são fundamentais na adaptação a atividades que aumentam a demanda metabólica. Camundongos selvagens que receberam infusão de RANKL também apresentaram aumento nas taxas de respiração do sóleo. As análises histológicas revelaram fibras com menor área seccional, aumento da marcação com SDH e na proporção de fibras do perfil IIa no gastrocnêmio. Imagens de microscopia eletrônica mostram o aumento no número de mitocôndrias. Os animais tratados com RANKL e submetidos a atividade física por 21 dias também apresentaram maior marcação de SDH nas fibras do gastrocnêmio comparado ao grupo não tratado e exercitado. Dessa forma, os resultados indicam que RANKL aumenta a biogênese mitocondrial e conversão dos tipos de fibras, proporcionando novas abordagens sobre a comunicação osso-músculo em um contexto de tecido saudável.

The operational unit bone-muscle refers to the mechanical interaction between bone and muscle and the communication via soluble factors that reciprocally regulate their metabolism. RANKRANKL-OPG system is classically described on osteoclast activation, and RANKL (receptor activator of NFkB ligand) and OPG (osteoprotegerin) are examples of osteokynes. However, the contribution of this system in healthy skeletal muscle fiber is unclear. Recently, our group described the role of RANK-RANKL activation in increasing mitochondrial reticulum, energy expenditure, and beige adipocyte differentiation. Skeletal muscle shows high levels of RANK expression, which is fundamental to sarcoplasmic reticulum activity. Thus, we hypothesize that RANK-RANKL signaling improves mitochondrial biogenesis and contributes to skeletal muscle fiber switch to an oxidative profile. The experiments were performed in 8-week-old male mice of C57BL/6J strain (wild-type), B6.129S4-Tnfrsf11b tm1Eac/J homozygous knockout to osteoprotegerin (OPG-/-), and heterozygous to osteoprotegerin expression (OPG-/-). All in vivo experiments were approved by Ethical Principles in Animal Research (CONCEA nº 0069/2020). C2C12 myoblast lineage differentiated into myotubes was used in vitro assays. Soleus of OPG-/- mice showed higher oxygen consumption rates than the OPG+/- group, which, in turn, also showed higher values than WT group, indicating the effect of high serum level of RANKL on skeletal muscle respiratory capacity. Myotubes from C2C12 lineage stimulated with RANKL presented higher expression of mitochondrial markers such as ATP synthase, Citrate synthase, NRF-2, MFN-2, and OPA-1 quantified by RT-qPCR, in addition to the increase of mitochondrial DNA, higher activity of responsive element of PPARs (PPRE) and Mitotracker® staining. RANKL stimuli activate ERK, p38, and CREB signaling pathways associated with metabolic adaptation, mitochondrial biogenesis, and oxidative metabolism. Myotubes stimulated with RANKL showed high spare respiratory capacity, and RNA-seq analysis also demonstrated that RANKL stimuli promote the enrichment of ERK signaling pathways, responses related to extracellular matrix remodeling, calcium signaling homeostasis, and regulation of vascular endothelial growth factors, which are fundamental in adapting to activities that increase metabolic demand. Soleus from WT mice treated with RANKL showed a higher oxygen consumption rate. Cross-section area analysis revealed muscle fiber with smaller diameter, higher SDH staining, and type IIa fiber proportion on gastrocnemius. Electron microscopy images revealed the increase of mitochondria number per area. Mice treated with RANKL and submitted to physical activity for 21 days showed higher SDH staining on gastrocnemius fibers compared to the non-treated and exercised group. In summary, these data indicate that RANKL improves mitochondrial biogenesis and fiber switch to an oxidative profile and provides new insights in bone-muscle communication in the healthy muscle fiber.