Neste trabalho aprofundamos a caracterização molecular de um fragmento de 2 kb-EcoRI previamente demonstrado amplificar no pufe de DNA B10 de B. hygida e conter sequências complementares à duas espécies de mRNA reguladas durante o desenvolvimento da glândula salivar do último estágio larval (Fontes et al.,1992). O sequenciamento deste fragmento de 2 kb e de um cDNA de 1 kb a êle complementar, em associação com experimentos de "5' extension", resultou no mapeamento fino de uma unidade de transcrição no fragmento de 2 kb. Na análise da sequência de 816 pb que flanqueia a unidade de transcrição a 5' nós identificamos sequências similares a elementos provados experimentalmente participar da regulação da transcrição de genes de Drosophila pelo hormônio ecdisona. Neste segmento de 816 pb nós também encontramos sequências similares a sequências conservadas no elemento ACE, geneticamente definido como controlador da amplificação gênica no domínio coriônico de Drosophila, e com a sequência ACS essencial para o funcionamento das sequências ARS como origens de replicação em cromossomos de levedura. A análise das pontas 5' e 3' dos mRNAs do gene BhB10, realizada através de experimentos de "5' extension" e por avaliação do tamanho das mensagens após a retirada da cauda poli A, indica que o gene BhB10 codifica uma mensagem que sofre um encurtamento da cauda poli A durante o desenvolvimento. O papel desse processo na expressão da proteína não foi abordado experimentalmente neste trabalho. A sequência de aminoácidos deduzida da fase de leitura aberta presente no cDNA indica que a proteína codificada pelo gene BhB10 é secretada pela glândula. Ainda neste trabalho, experimentos de hibridação em "northern blot" mostram que os mRNAs do BhB10 estão presentes nas três diferentes regiões da glândula salivar de B. hygida. Uma vez que em uma destas regiões (chamada S2) o pufe B10 não se forma, nossos resultados indicam que a formação deste pufe não é consequência da atividade transcricional per se. Em vez disto, como sugerido por resultados preliminares não apresentados aqui, a falta de amplificação desse gene na região glandular S2 poderia explicar o fato do pufe de DNA não se formar em cromossomos de S2. Nossas observações de que na região S2 os mRNAs do gene BhB10 estão presentes em menor quantidade, quando comparado às outras duas regiões glandulares, são compatíveis com a falta de amplificação gênica na região S2 e enfatizam o papel da amplificação gênica como um mecanismo de controle da expressão gênica.

In this work we extend the molecular characterization of a 2 kb EcoRI fragment, previously shown to amplify in the DNA puff B10 of B. hygida, and to contain sequences complementary to two mRNAs regulated developmentally in the larvae salivary gland (Fontes et al., 1992). The sequencing of this 2 kb genomic fragment and of a 1kb cDNA complementary to it, together with experiments of 5' extension, allowed the fine mapping of a complete transcription unit to the 2 kb fragment. In the analysis of 816 pb flanking the 5' transcription unit we identified sequences similar to the elements experimentally proved to participate in the regulation of Drosophila genes transcription by the molt hormone ecdysone. In this 816 pb segment we also found sequences similar to ones conserved in the amplification control element (ACE), that was genetically defined in the Drosophila chorion domain, and to the consensus sequence ACS found in the replication origin of yeast chromosomes. The analysis of the 5' and 3' structure of the BhB10 mRNAs, by 5' extension and deletion of the mRNA poly A tails, indicates that the BhB10 gene encodes a message that suffers a poly A tail shortening during development. What role this process could have in the expression of the protein was not experimentally accessed here. The sequence deduced from the open reading frame (ORF) present in the cDNA indicates that the encoded protein is secreted by the gland. Also in this work, the analysis by developmental northern blot hybridization shows that the BhB10 mRNAs are present in the three different regions of the salivary gland. Since in one of these regions (called S2) the DNA puff B10 is not formed, our results indicate that the puff formation is not a consequence of the transcription activity per se. Instead, as sugested by preliminary results not presented here, the lack of this gene amplification in the S2 gland region may explain why the DNA puff is not formed in the S2 chromosomes. Our observation that in the S2 region there is less BhB10 mRNA, compared with the other two gland regions, is also compatible with the lack of gene amplification in the S2 region and emphasizes the role of gene amplification as a control of gene expression.