Oropouche (OROV) é um vírus de RNA de fita simples pertencente à família Bunyaviridae, gênero Orthobunyavirus e sorogrupo Simbu, que causa a segunda mais freqüente arbovirose febril aguda no Brasil. Estima-se que mais de meio milhão de casos de febre do OROV ocorreram no país nos últimos 30 anos. A febre do Oropouche é relatada principalmente na região Amazônica, porém, com o aquecimento global, o desmatamento, e a redistribuição de insetos vetores, o risco da disseminação do vírus para outras áreas do Brasil e da América do Sul aumenta. Tem sido demonstrado que grande variedade de vírus induzem apoptose quando infectam células em cultura e modelos animais. Este estudo foi feito para determinar se a apoptose desempenha um papel importante no efeito citopático causado pelo vírus Oropouche in vitro em células HeLa. A infecção dessa cultura de células resultou em fragmentação do DNA, detectada pelos ensaios de TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nicked-end labeling), eletroforese em gel de agarose e análise do conteúdo nuclear por citometria de fluxo (população Sub-G1). Os resultados mostraram que células HeLa infectadas por OROV apresentaram um alto grau de fragmentação do DNA após 36 horas de infecção. Ativação de caspase 9, caspase 3 e liberação de citocromo c da membrana da mitocôndria também foram detectados durante a infecção pelo vírus, conforme revelado em ensaios de "western blot" e citometria de fluxo. A inoculação de vírus inativados por radiação ultravioleta não induziu apoptose neste modelo, revelando que a ligação do vírus com as células não é suficiente para desencadear esta resposta. O tratamento das células com Cloroquina e Cicloheximida também revelaram que a saída do vírus do endossomo e a replicação do mesmo são necessárias para a indução de apoptose. Além disso, foi mostrado que inibidores de caspases impediram a apoptose induzida pelo OROV sem afetar a replicação do vírus. A clonagem e expressão da proteína não estrutural NSs de OROV em células HeLa revelou um potencial papel desta proteína no mecanismo de indução de apoptose pelo vírus. Nossos resultados mostram então que apoptose é uma importante conseqüência da infecção pelo vírus Oropouche in vitro, a qual ocorre através de uma via intracelular que envolve a mitocôndria, e que é provavelmente acionada durante o processo de replicação e síntese das proteínas virais. A análise da indução de apoptose foi também realizada em modelo animal, onde foi observada marcação de TUNEL em tecidos de cérebros de hamsters infectados por OROV, sugerindo que o processo de apoptose também possa ser importante para infecção in vivo.

Oropouche (OROV) is a single-stranded RNA virus of the family Bunyaviridae, genus Orthobunyavirus, which causes the second most frequent acute arboviral febrile illness in Brazil, where over half a million cases have been recorded ín the past 30 years. OROV fever has been registered almost exclusively in the Amazon region, but global warming, deforestation and redistribution of vectors and reservoir animals, increase the risk of Oropouche virus dissemination to other areas of Brazíl and South America. Virus isolation was also described in patients in Peru, Venezuela, Panama and Trinidad. OROV causes a highly cytolytical infection in cultured cells with characteristic cytopathic effect appearing 48 hours post infection. OROV experimental infection in hamsters induces serious involvement of the central nervous system, with virtually no inflammation and necrosis. We assessed whether apoptosis plays a role in OROV induced death of HeLa cells. lnfection of HeLa cells by OROV resulted in DNA fragmentation, detected by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nicked-end labeling (TUNEL) assay, gel electrophoresis and by analysis of the Sub-G1 population on cell cycle analysis by flow citometry at 36 hours post infection. Activation of caspase 9, caspase 3 and release of cytochrome C from the mitochondrial membrane were also detected during viral infection, as shown by western blot analysis. UV inactivated OROV did not induce apoptosis in this model, revealing that virus-cell binding was not sufficient to induce it. The treatment of cells with chloroquine and cycloheximide indicated that viral uncoating and replication are needed for apoptosis induction. Furthermore, treatment of the cells with pan-caspase inhibitor prevented OROV-induced apoptosis without affecting virus replication. The induction of apoptosis was also analysed in vivo on the brain tissue of infected hamsters by TUNEL assay, suggesting that this phenomenon is also reported on animal models. The cloning and expression of the non-structural protein NSs from OROV revealed that this factor may be a potential apoptosis inducer. Our results show that apoptosis is an important consequence of OROV virus infection in vitro, which occurred by an intracellular pathway involving the mitochondria, triggered during the process of viral protein synthesis and replication.