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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2021.tde-11062021-090108
Document
Author
Full name
Jackeline Souza Araujo
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2021
Supervisor
Committee
Espreafico, Enilza Maria (President)
Kowaltowski, Alícia Juliana
Murakami, Mário Tyago
Silva, Luis Lamberti Pinto da
Title in Portuguese
Caracterização funcional e da dinâmica espacial da miosina-Va no processo de fissão mitocondrial
Keywords in Portuguese
Melanoma
Miosina-Va
Mitocôndria
mitoSpire1
Rab11a
Abstract in Portuguese
A arquitetura mitocondrial está envolvida em várias funções cruciais para a viabilidade celular, como proliferação, senescência e sinalização. Em particular, a dinâmica mitocondrial através do equilíbrio entre fusão e fissão mitocondriais desempenha um mecanismo central para ajustar as necessidades metabólicas da célula. Recentemente, tem se dado um grande foco à participação do citoesqueleto e dos motores moleculares nos processos requeridos para homeostase mitocondrial. Em especial, a proteína mitoSpire1, uma proteína nucleadora de actina que possui localização mitocondrial, foi mostrada ser importante na fissão mitocondrial. Interessantemente, proteínas Spire interagem com os motores moleculares miosina-V. A miosina-Va, um motor molecular dependente da actina, está envolvida em diversas funções cruciais para célula e dados já publicados do nosso laboratório indicam que ela também tem uma localização mitocondrial. Devido a isso, nós postulamos que a miosina-Va estaria envolvida nos processos de dinâmica mitocondrial. Para responder a estas questões, inicialmente nós confirmamos a localização da miosina-Va na superfície mitocondrial através de imagens confocais e de super-resolução. Posteriormente, vimos que a miosina-Va interage diretamente com mitoSpire1, e que seu recrutamento para MME aumenta com a superexpressão de mitoSpire1, tornando a sua interação mitocondrial ainda mais evidente. Para entendermos se a miosina-Va desempenha algum papel referente à mitocôndria, nós a modulamos em células de melanoma A375 através do silenciamento com shRNAs e do nocaute (KO) utilizando CRISPR. Observamos que estas células possuem mitocôndrias alongadas e com um menor número de eventos de fissão após a depleção da miosina-Va. Esse fenótipo é resgatado através da superexpressão de um construto contendo a miosina-Va inteira. Além disso, através de vídeo-microscopias nós observamos que a miosina-Va é localizada nos pontos de fissão mitocondrial, e que essa localização é parcialmente perdida em células KO para mitoSpire1. Em busca do mecanismo pelo qual a miosina-Va interfere na fissão mitocondrial, nós investigamos a sua interação com outras proteínas importantes deste processo. A partir disso, observamos que a localização da miosina-Va nos pontos de fissão mitocondrial coincide também com agrupamentos de Drp1, que é a principal proteína responsável pela fissão mitocondrial. Nossos dados também mostram a interessante localização conjunta da miosina-Va com Rab11a nos pontos de fissão mitocondrial, a qual também é parcialmente perdida em células KO para mitoSpire1. Por fim, nós vimos que as células KO para miosina-Va possuem menores taxas de consumo de oxigênio, quando comparadas com células controle, assim como menores níveis de produção de ATP. Em busca das consequências dessa menor eficiência energética, nós avaliamos algumas funções tumorigênicas das células, como a clonogenicidade e a migração, vimos que estas capacidades se encontram diminuídas após o KO da miosina-Va. Portanto, nossos dados são indicativos de um papel da miosina-Va na fissão mitocondrial, e nos indicam que possivelmente a miosina-Va, mitoSpire1 e Rab11a funcionem como um complexo proteico envolvido na regulação da fissão mitocondrial. Concluindo, a falta de função da miosina-Va provoca um desequilibro na fissão mitocondrial associada a uma menor eficiência energética, que leva a uma diminuição das propriedades tumorigênicas das células de melanoma A375 e podem explicar algumas das disfunções neuromusculares severas associadas com a Síndrome de Griscelli tipo 1.
Title in English
Characterization of the functional and spatial dynamics of myosin Va in the mitochondrial fission process
Keywords in English
Melanoma
Mitochondria
mitoSpire1
Myosin-Va
Rab11a
Abstract in English
Mitochondrial architecture is involved in several crucial functions to cell viability, such as proliferation, senescence and signaling. In particular, mitochondrial dynamics through the balance between mitochondrial fusion and fission plays a central role in adjusting the cell metabolic needs. Recently, there has been a great focus on the participation of the cytoskeleton and molecular motors in the processes required for mitochondrial homeostasis. In particular, mitoSpire, an actin-nucleating protein that has a mitochondrial location, has been shown to be important in mitochondrial fission. Interestingly, Spire proteins interact with myosin-V molecular motors. Myosin-Va, an actin based molecular motor, is involved in a number of crucial cell functions, and published data from our laboratory indicate that it also has a mitochondrial location. In this context, we hypothesized that myosin-Va could be involved in the processes of mitochondrial dynamics. To answer these questions, we initially confirmed the localization of myosin-Va to mitochondria surface using super-resolution and confocal images. Later, we saw that myosin-Va interacts directly with mitoSpire1, and that its recruitment to the OMM increases with the overexpression of mitoSpire1, making myosin-Va mitochondrial interaction even more evident. To understand if myosin-Va plays a role in the mitochondria, we modulate it in A375 melanoma cells through knockdown with shRNA and also nocaute (KO) using CRISPR. We observed that these cells have elongated mitochondria and fewer fission events after myosin-Va depletion. This phenotype is rescued by overexpressing a construct containing the full length myosin-Va. In addition, through video microscopy we observed that myosin-Va is localized at mitochondrial fission points, and that this location is partially lost in mitoSpire1 KO cells. In search of the mechanism by which myosin-Va interferes with mitochondrial fission, we investigated its interaction with other important proteins in this process. We observed that the localization of myosin-Va at the mitochondrial fission points also coincides with clusters of Drp1, which is the central protein responsible for mitochondrial fission. Our data also show the interesting localization of myosin-Va and Rab11a to the mitochondrial fission points, which is also partially lost in mitoSpire1 KO cells. Finally, we found that KO cells for myosin-Va have lower oxygen consumption rates when compared to control cells, as well as lower levels of ATP production. In search for the consequences of this lower energy efficiency, we evaluated some tumorigenic functions of the cells, such as clonogenicity and migration, we observed that these capacities are reduced after myosin-Va KO. Therefore, our data are indicative of a role for myosin-Va in mitochondrial fission, and indicate that myosin-Va, mitoSpire1 and Rab11a could possibly act as a protein complex that is involved in the regulation of mitochondrial fission. In conclusion, myosin-Va depletion causes an imbalance in mitochondrial fission associated with lower energy efficiency, which leads to a decrease in tumorigenic properties of A375 melanoma cells and may explain some of the severe neuromuscular dysfunctions associated with the Griscelli syndrome-type 1.
 
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Publishing Date
2021-06-18
 
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