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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2021.tde-11042022-142729
Documento
Autor
Nome completo
Suellen Gomes Salustiano
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2021
Orientador
Banca examinadora
Arruda Neto, Eurico de (Presidente)
Silva, Thiago Aparecido da
Bellei, Nancy Cristina Junqueira
Durigon, Danielle Bruna Leal de Oliveira
Título em português
Infecção de tonsilas hipertróficas por metapneumovírus humano
Palavras-chave em português
Metapneumovírus
Persistência
Tonsilas
Resumo em português
O metapneumovírus humano (HMPV) é um importante agente causador de infecções respiratórias agudas (IRA), com tropismo para o epitélio respiratório e elevado impacto em morbidade e mortalidade na infância em todo o mundo. Porém, pouco se sabe sobre sua patogênese, especialmente em infecções de tecidos não epiteliais. Estudos prévios mostraram o genoma de HMPV em tecidos tonsilares de crianças com hipertrofia adenoamigdaliana. Nosso objetivo geral foi estudar a infecção por HMPV em tecidos de tonsilas de crianças sem sintomas de IRA, identificar as células-alvo e confirmar a presença de replicação de HMPV nesses tecidos, que podem ser fontes de disseminação do vírus na comunidade. Para tanto, foi realizada RT-PCR para o genoma do HMPV em tecidos linfoides utilizando o kit Taqman® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystem). Citometria de fluxo foi usada para quantificar diferentes imunofenótipos de células infectadas e a localização in situ foi feita em cortes de tecido embebidos em parafina e analisados por imuno-histoquímica usando o método de SIMPLE (serial immuno-peroxidase labeling and erasing). Além das células epiteliais, HMPV foi detectado em células linfomononucleares nos centros germinativos, na zona do manto e nas áreas interfoliculares dos tecidos tonsilares. As células-alvo infectadas por HMPV foram identificadas e a análise imunofenotípica mostrou que células naturalmente infectadas foram positivas para marcadores CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, CD123 e CD14. Observou-se que células linfoides foram mais frequentemente infectadas em amígdalas, enquanto células mieloides foram mais frequentemente infectadas em adenoides. Um dos principais achados deste estudo foi alta frequência de macrófagos M2 (CD206 + CD80 +), e não M1, infectados em ambos os tecidos. Além de detectar macrófagos positivos para HMPV in vivo, foi demonstrada a suscetibilidade à infecção pelo HMPV em linhagem celular de macrófagos. HMPV infeccioso foi recuperado de amígdalas humanas em cultura de células, induzindo efeito citopático caracterizado com formação de sincícios, arredondamento celular e extensa ruptura da monocamada, o que foi confirmado por imunocitoquímica. O presente estudo mostra pela primeira vez que o HMPV infecta tonsilas hiperplásicas de crianças assintomáticas, que podem assim ser potenciais reservatórios do vírus, um achado significante para a epidemiologia do vírus.
Título em inglês
Infection of hypertrofic tonsils by human metapneumovirus
Palavras-chave em inglês
Metapneumovirus
Persistence
Tonsils
Resumo em inglês
Human metapneumovirus (HMPV) is an important causative agent of acute respiratory infections (ARI), which tropism for the respiratory epithelium is known and a leading cause of childhood morbidity and mortality worldwide. However, little is known about the pathogenesis of HMPV, especially infections of tissues other than the airways epithelia. We have previously reported that HMPV genome was detected in tonsillar tissue taken from children with hyperplastic palatine tonsils and adenoids. In the present study, we analyzed HMPV infection in tonsillar tissues from asymptomatic children, identify target cells and investigate HMPV replication in these tissues, raising the possibility that hyperplastic tonsils may be sources of HMPV for the community. To achieve our goal, RT-PCR assay was performed to detect genome HMPV in lymphoid tissues using Taqman® Universal PCR Master Mix Kit (Applied Biosystem). We used flow cytometry to quantify infected phenotypes and in situ localization was performed in sliced tissues embedded in paraffin to perform immunohistochemistry followed by SIMPLE (serial immuno-peroxidase labeling and erasing). In addition to epithelial cells, we were also able to detect HMPV in germinal centers, mantle zone and in interfolicular region. Moreover, serial immunohistochemical stainings showed that naturally infected cells were positive for CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, CD123 and CD14 markers. We observed that lymphoid cells were the most frequently infected cell types in palatine tonsils, whereas HMPV positive myeloid cells were more frequently detected in adenoids. One of the main findings of this study was the high frequency of M2 and not M1 infected macrophages (CD206+CD80+) in both tissues. In addition to detect HMPV positive macrophages in vivo, the susceptibility to HMPV infection was demonstrated. Infectious HMPV from human tonsils was recovered in cell culture with visible cytopathic effect, characterized by syncytia formation, cell rounding and extensive monolayer disruption, which was confirmed by immunocytochemistry. The present study shows for the first time that HMPV infects hyperplastic tonsils of asymptomatic children, which may thus be potential reservoirs of the virus, a significant finding for the epidemiology of the virus.
 
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Data de Publicação
2022-04-14
 
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