As infecções fúngicas invasivas (IFIs) representam um sério problema de saúde pública. Dentre as doenças negligenciadas, as IFIs apresentam taxas de mortalidade em patamares semelhantes aos ocasionados pela malária ou tuberculose. A criptococose, manifestação da infecção causada por Cryptoccocus spp., é responsável por cerca de 180.000 mortes anuais globalmente. O comprometimento do sistema imune é o maior fator de risco para o estabelecimento da infecção, e as espécies Cryptococcus gattii e Cryptococcus neoformans são as de maior relevância clínica, podendo acometer tanto indivíduos imunocomprometidos quanto imunocompetentes. Esses patógenos apresentam um diverso arsenal de fatores de virulência e mecanismos de escape/subversão da resposta imunológica do hospedeiro, seja impedindo ou sobrevivendo à fagocitose, ou comprometendo a diferenciação e atuação de subtipos de células T importantes no controle da infecção. Para contornar esse processo, a presente dissertação avaliou o redirecionamento de células T e natural killer (NK) para o reconhecimento de Cryptoccocus spp. via interação com o polissacarídeo glucuronoxilomanana (GXM) presente na cápsula desse patógeno. Para isso, o receptor antigênico quimérico (CAR) com capacidade de reconhecer GXM, denominado GXMCAR, foi expresso em células T e NK através da transdução com partículas lentivirais. O redirecionamento e efeitos funcionais desencadeado por diferentes GXMR-CAR foi avaliado frente a Cryptococcus spp., sendo considerado os receptores caracterizados pelas seguintes diferenças estruturais: porções hinge-transmembrana, com IgG4-hinge e CD28-transmembrana, GXMR-IgG4-28ζ; hinge-transmembrana contendo CD8α acoplado com domínio de transdução de sinal 4-1BB ou CD28, GXMR-8-BBζ e GXMR-8-28ζ, respectivamente. Células Jurkat foram adotadas como plataforma de expressão de GXMR-CAR e de avaliação frente a C. gattii R265, C. neoformans H99 ou isolados clínicos. Células da linhagem NK-92 foram consideradas na expressão de GXMR-CAR para avaliar o controle da infecção in vitro por Cryptococcus spp. A modificação de células Jurkat com GXMR-CAR demonstrou uma maior expressão dos construtos contendo CD8α como hinge-transmembrana. A expressão de GXMR-8-BBζ ou GXMR8-28ζ propiciou melhor taxa de expansão celular comparado com as células expressando GXMR-IgG4-28ζ. A modificação com GXMR-CAR contendo CD8α como hinge/transmembrana induziu a sinalização tônica em células Jurkat, e a molécula coestimulatória 4-1BB desencadeou os maiores níveis de produção de IL-2 em comparação com CD28. Mesmo na presença da sinalização tônica, GXMR-8-BBζ ou GXMR-8-28ζ induziram um aumento significativo nos níveis de IL-2 após a incubação com GXM solúvel ou leveduras inativadas de Cryptococcus spp, enquanto a expressão de GXMRIgG4-28ζ não induziu a ativação das células. A inibição da via de sinalização do GXMRCAR com o fármaco dasatinibe, inibidor de tirosina quinases da família Src, atenuou a sinalização tônica mediada por GXMR-8-137z e GXMR-8-28z. Além disso, as células modificadas com GXMR-CAR tiveram redução da taxa proliferativa após a incubação com as leveduras inativadas, fato atenuada com a adição de dasatinibe no cultivo celular. Em complemento, células Jurkat transduzidas com GXMR-8-BBζ ou GXMR-8-28ζ são capazes de reconhecerem diferentes sorotipos de C. gattii e C. neoformans derivados de isolados clínicos, e isso resultou na ativação celular. A expressão dos diferentes GXMRCAR na linhagem celular NK-92 demonstrou maiores taxas de expressão dos construtos contendo CD8α como hinge-transmembrana, com a frequência de células modificadas com GXMR-CAR se mantendo relativamente estável por prolongados períodos de cultivo. A atividade fungicida das células NK-92 modificadas com GXMR-8-BBζ foi avaliada frente ao Cryptococcus spp., e o co-cultivo das células com as leveduras resultou na produção de elevados níveis de INF-γ, além disso, a expressão de GXMR-8-BBζ medeia a sinalização tônica de células NK-92. Essas células foram capazes de aumentarem a susceptibilidade de Cryptococcus spp. frente a anfotericina B, enquanto o efeito fungicida e fungistático não foi alcançado. Em conclusão, a caracterização de distintos construtos de GXMR-CAR frente ao ligante, em diferentes tipos celulares, elencou os domínios de GXMR-CAR que resultaram em melhor funcionalidade do receptor na presença de Cryptococcus spp.

Invasive fungal infections (IFIs) represent a great challenge to public health. Among neglected diseases, IFIs are responsible to cause as many deaths as malaria or tuberculosis. The clinal manifestation of Cryptococcus spp. infection is the cryptococcosis, and is responsible to cause around 180.000 deaths annually. The main risk factor to the development of cryptococcosis is the impairment of immune system, and the species Cryptococcus gattii and Cryptococcus neoformans represent greater clinical relevance, accountable for cause disease whether in immunocompromised or immunocompetent individuals. These pathogens display a diverse arsenal of virulence factors and physiological mechanisms that allow evasion from the host immune response, evading phagocytosis and modulating the T cell differentiation. To overcome these characteristic of Cryptococcus spp, this work evaluated the redirection of T cells and natural killer cells (NK) to recognize Cryptococcus spp. through the interaction with the polysaccharide glucuronoxilomanana (GXM) in the Cryptococcus capsule. For this, the chimeric antigen receptor (CAR) specific for this structure, GXMR-CAR, was expressed in T and NK cells modified with lentiviral transduction. Different constructs of GXMRCAR were considered to evaluate the functional properties against yeasts of Cryptococcus spp., and it is based in the following structural modifications: the IgG4 as hinge and CD28 as transmembrane compose the construct GXMR-IgG4-28ζ; CD8α as hingetransmembrane is present in the GXMR-8-BBζ and GXMR-8-28ζ; the co-stimulatory molecule is represented by 4-1BB (GXMR-8-BBζ) or CD28 (GXMR-IgG4-28ζ and GXMR-8-28ζ). Jurkat cells were considered as expression plataform to evaluate GXMRCAR against the reference species C. gattii R265 and C. neoformans H99 or clinical isolates of Cryptococcus spp. The cell linage NK-92 was used to perform in vitro studies evaluating the control of Cryptococcus spp. infection. The GXMR-CAR carrying CD8α as hinge-transmembrane demonstrated greater expression in Jurkat cells and the cells modified with GXMR-8-BBζ or GXMR-8-28ζ showed greater cell proliferation compared with GXMR-IgG4-28ζ during culture. Jurkat cells expressing GXMR-CAR with CD8α demonstrated tonic singnaling, and the co-stimulatory molecule 4-1BB was responsible to induce more levels of IL-2 compared with CD28. Besides the tonic signaling, the IL-2 production by the cells modified with GXMR-8-BBζ or GXMR-8-28ζ was increased upon incubation with soluble GXM or inactivated yeast of Cryptococcus spp, whereas the Jurkat cells expressing GXMR-IgG4-28ζ did not trigger cell activation. When the GXMR-CAR signaling cascade is inhibited by the use of dasatinib, a Scr tyrosine kinase inhibitor, the tonic signaling is attenuated. Moreover, the cell activation induced by interaction of GMXR-CAR and yeast is also attenuated by dasatinib and the proliferation of the cells treated is ameliorated when in presence of yeast. In addition, Jurkat cells modified with GXMR-8-BBζ or GXMR-8-28ζ are able to recognize different clinical isolates serotypes of C. gattii and C. neoformans, resulting in cell activation. The expression of GXMR-CAR in NK-92 cells demonstrated greater rates of expression of the CD8α-containing constructs, and the modified population remained stable for longer periods of culture. The fungicide capacity of NK-92 expressing GXMR-8-BBζ was evaluated against viable yeasts of Cryptococcus spp. The co-culture of cells and yeast resulted in NK activation, with increasing in INF-γ production, and we verified that GXMR-8-BBζ mediated tonic signaling in this cell line. The modified cells were able to increase the susceptibility of Cryptococcus spp. to amphotericin B, whereas the fungicide and fungistatic effect were not observed. In conclusion, the functional characterization of distinct GXMR-CAR in different cell lines and against a set of ligands, indicated the importance of CAR domains that resulted in the best options of GXMR-CAR against Cryptococcus spp.