O inflamassoma é um complexo multiproteico envolvido na ativação de caspases inflamatórias em resposta a sinais ambientais ou a patógenos. Após o reconhecimento do ligante, o complexo inflamassoma é formado e medeia a clivagem e ativação de pró-IL-1β e pró-IL-18, além de gasdermina-D, levando a secreção das citocinas em suas formas ativas e a morte celular inflamatória, conhecida como piroptose. Dentre os diferentes inflamassomas, NLRC4 e NLRP3 são os mais estudados. O inflamassoma de NLRC4 apresenta um papel crucial na defesa do hospedeiro contra patógenos intracelulares, incluindo Salmonella, Shigella, Legionella e Pseudomonas. Além disso, já foi descrito que mutações no gene de NLRC4 estão ligadas ao aparecimento e progressão de doenças inflamatórias como MAS (Macrophage Activation Syndrome), e enterocolite de início neonatal. Apesar de ser um dos inflamassomas mais estudados, mecanismos envolvidos na ativação e regulação da via de NLRC4 ainda precisam ser identificados. Neste trabalho, nós otimizamos o protocolo de deleção gênica por CRISPR-Cas9, gerando macrófagos primários derivados de medula óssea nocautes para os genes de ASC e NLRC4. Além disso, baseado em ensaios fenotípicos de replicação de L. pneumophila, observamos que a possível deleção dos nossos genes de interesse não levou ao aumento da replicação bacteriana, sugerindo que as proteínas não apresentam papel relevante para a via do inflamassoma de NLRC4.

The inflammasome is a multiprotein complex involved in the activation of inflammatory caspases in response to environmental signals or pathogens. After ligand recognition, the inflammasome complex is formed and mediates the cleavage and activation of pro-IL-1β and pro-IL-18, as well as gasdermin-D, leading to the secretion of cytokines in their active forms and inflammatory cell death, known as pyroptosis. Among the different inflammasomes, NLRC4 and NLRP3 are the most studied. The NLRC4 inflammasome plays a crucial role in host defense against intracellular pathogens, including Salmonella, Shigella, Legionella and Pseudomonas. Furthermore, mutations in the NLRC4 gene have been described to be linked to the onset and progression of inflammatory diseases such as MAS (Macrophage Activation Syndrome), and neonatal onset enterocolitis. Despite being one of the most studied inflammasomes, mechanisms involved in the activation and regulation of the NLRC4 pathway have yet to be identified. In this work, we optimized the CRISPR-Cas9 technique in bone marrow-derived macrophages for the deletion of genes previously identified in our laboratory, in order to evaluate a possible role in NLRC4 inflammasome activation in response to Legionella pneumophila infection. Throughout this project we were able to standardize and optimize the gene deletion protocol by CRISPR Cas9, generating primary bone marrow-derived macrophages nocautes for ASC and NLRC4 genes. Furthermore, we observed that the possible deletion of our genes of interest, did not lead to increased bacterial replication, suggesting that the deleted proteins do not seem to play a relevant role in the functions of the NLRC4 inflammasome.