Nef é uma proteína multifuncional do HIV que contribui para o aumento da viremia e a progressão da doença. Nef exerce essas funções ao modificar os níveis de expressão de várias proteínas antivirais em diferentes compartimentos da célula hospedeira, como a membrana plasmática, complexo de Golgi e vesículas extracelulares (EVs). Nesse trabalho foi realizada uma análise proteômica quantitativa de EVs liberadas por linfócitos a fim de caracterizar as mudanças globais em seu conteúdo proteico promovidas por Nef. A hipótese testada foi de que Nef teria alvos ainda não identificados com seus níveis alterados nas EVs. Dentre as diversas proteínas com níveis modificados, os resultados mostraram que Nef é capaz de reduzir os níveis da proteína antiviral IFITM2 em EVs. A família de proteínas IFITMs (Interferon-Induced Transmembrane) age contra uma diversidade de vírus, incluindo: influenza, dengue, zika e HIV. A expressão de IFITMs é regulada por interferon e pelo menos três IFITMs diferentes exibem atividade antiviral (IFITM1, IFITM2 e IFITM3). No contexto da infecção pelo HIV, foi anteriormente mostrado que as IFITMs impedem a fusão do vírus com a membrana plasmática, favorecendo o direcionamento do vírus para uma via de degradação lisossomal. Até o momento, não há evidências de proteínas virais que antagonizam as IFITMs. A descoberta de que Nef reduz os níveis de IFITM2 em EVs motivou a investigação do possível papel de Nef em antagonizar IFITMs em linfócitos. Ensaios de western blot demonstraram que Nef reduz os níveis proteicos de IFITM1, IFITM2 e IFITM3 nas EVs de células T, mas não afeta os níveis totais intracelulares. Ensaios de biotinilação e enriquecimento de lipid rafts, mostraram que Nef diminui a associação de IFITM1, IFITM2 e IFITM3 com a membrana plasmática e com domínios de lipid rafts, respectivamente, sendo este o principal local da biogênese de EVs em linfócitos. A análise da distribuição subcelular de IFITM3 na presença de Nef mostrou que a proteína tem seus níveis reduzidos na superfície celular e é redistribuída a partir do citosol para a região perinuclear. Ensaios de transferência de proteínas por meio de EVs permitiram observar que IFITM3 pode ser eficientemente entregue para células aceptoras. Por fim, análises da expressão dos genes IFITMs em resposta ao interferon revelaram que Nef bloqueia fortemente a sua expressão, a partir do bloqueio da via de sinalização de IFN do tipo I. Os resultados permitem concluir que Nef antagoniza IFITMs na transcrição e pós-tradução, bloqueando sua expressão induzida por interferon e removendo essas proteínas dos domínios de lipid rafts na membrana plasmática. Tal ação leva a uma exclusão sustentada de IFITMs de locais de brotamento de EVs.

Nef is a multifunctional HIV protein that contributes to increased viremia and disease progression. Nef exerts these functions by modifying the expression levels of various antiviral proteins in different compartments of the host cell, such as the plasma membrane, Golgi apparatus, and extracellular vesicles (EVs). In this work, a quantitative proteomic analysis of EVs released by lymphocytes was performed to characterize the global changes in their protein content promoted by Nef. The hypothesis tested was that Nef would have unidentified targets with altered levels in the EVs. Among the various proteins with modified levels, the results showed that Nef is able to reduce the levels of the antiviral protein IFITM2 in EVs. The IFITMs (Interferon-Induced Transmembrane) family of proteins act against various viruses, including influenza, dengue, zika, and HIV. Interferon stimulation regulates the expression of IFITMs, and at least three different IFITMs exhibit antiviral activity (IFITM1, IFITM2, and IFITM3). In the context of HIV infection, it was previously shown that IFITMs prevent the fusion of the virus with the plasma membrane, favoring the targeting of the virus to a lysosomal degradation pathway. To date, there is no evidence of viral proteins that antagonize IFITMs. The discovery that Nef reduces IFITM2 levels in EVs motivated the investigation of the possible role of Nef in antagonizing IFITMs in lymphocytes. Western blot assays demonstrated that Nef reduces IFITM1, IFITM2, and IFITM3 protein levels in T cell EVs but does not affect total intracellular levels. Biotinylation and lipid raft enrichment assays showed that Nef decreases the association of IFITM1, IFITM2, and IFITM3 with the plasma membrane and lipid raft domains, respectively, which is the leading site of EV biogenesis in lymphocytes. Analysis of the subcellular distribution of IFITM3 in the presence of Nef showed that the protein has reduced levels on the cell surface and is redistributed from the cytosol to the perinuclear region. Protein transfer assays using EVs allowed us to observe that IFITM3 can be efficiently delivered to acceptor cells. Finally, analyzes of the expression of IFITMs genes in response to interferon revealed that Nef strongly blocks its expression by blocking the type I IFN signaling pathway. The results allow us to conclude that Nef antagonizes IFITMs in transcription and post-translation, blocking their interferon-induced expression and removing these proteins from the lipid raft domains in the plasma membrane. Such action leads to a sustained exclusion of IFITMs from EV budding sites.