As infecções fúngicas invasivas representam um grave problema de saúde pública afetando mais de um bilhão de pessoas em todo o mundo, e entre os principais fungos causadores dessas doenças se destacam o Cryptococcus gattii e C. neoformans por acometerem indivíduos imunocompetentes e imunocomprometidos, respectivamente. A taxa de mortalidade anual está estimada em 625.000 óbitos decorrentes da criptococose. Cryptococcus spp. apresenta diversos fatores de virulência que medeiam a subversão da resposta imunitária do hospedeiro, fato que está associado a uma reduzida atividade microbicida de células fagocítica e a um comprometimento da diferenciação de células T em perfis efetores contra a criptococose. A cápsula polissacarídica é o principal fator de virulência de Cryptococcus spp., sendo composto majoritariamente por GXM (glucuronoxilomanana) que mascara componentes da parede celular fúngica passíveis de reconhecimento por células da imunidade. A terapia com antifúngico para o tratamento da criptococose leva a efeitos colaterais adversos ao hospedeiro e também ao aumento da resistência por Cryptococcus spp. aos antifúngicos. Com isso, imunoterapias têm sido propostas no tratamento da criptococose, e uso da terapia celular através de células T ou NK modificadas com receptor antigênico quimérico (CAR) é uma estratégia terapêutica promissora contra a criptococose. Estudos prévios demonstraram que o redirecionamento de células T expressando um CAR, contendo um domínio de reconhecimento específico para o GXM de Cryptococcus spp., foi capaz de reduzir a progressão da criptococose. Dessa forma, o presente trabalho investigou o efeito de distintos GXMR-CAR contendo diferentes scFv (domínio variável de cadeia única), oriundos dos clones 2H1 e 18B7 de anticorpos monoclonais (mAb) específicos para GXM, como constituintes da região de reconhecimento do antígeno de GXMR-CAR. Os vetores lentivirais dos construtos gerados 18B7-GXMR-CAR e 2H1-GXMR-CAR compartilham as sequências codificadoras para a região hinge/transmembrana (molécula de CD8) e a porção intracelular composta da molécula coestimulátoria CD137 (4-1BB) acoplado ao CD3ζ. Os plasmídeos de 18B7-GXMR-CAR e 2H1-GXMR-CAR foram co-transfectados com pMD2 e pPAX2 em células HEK-293T para a produção de partículas lentivirais visando a modificação de células Jurkat e NK-92. As células Jurkat modificadas com 18B7-GXMR-CAR e 2H1-GXMR-CAR reconheceram GXM solúvel de C. gattii (R265) e C. neoformans (H99), e essas células modificadas após a incubação com GXM solúvel ou leveduras de C. gattii ou C. neoformans produziram níveis elevados de IL-2. Além disso, células Jurkat expressando 18B7-GXMR-CAR ou 2H1-GXMR-CAR apresentaram sinalização tônica e de forma mais pronunciada após a expressão de 18B7- GXMR-CAR, e a ativação celular mediada pelos construtos de GXMR-CAR na presença ou ausência do alvo foi drasticamente mitigada após a incubação com Dasatinibe, um inibidor farmacológico de proteínas quinases da família Src. Os diferentes níveis de sinalização tônica desencadeado por 18B7-GXMR-CAR apresentaram forte relação com a oligomerização do scFv de GXMR-CAR na superfície celular, como constatado na microscopia de fluorescência uma elevada clusterização de 18B7-GXMR-CAR e uma distribuição mais homogênea de 2H1- GXMR-CAR. Os construtos de GXMR-CAR também mediaram a ativação de células T modificadas após co-cultivo com isolados clínicos de C. neoformans ou C. gattii e, além disso, as células modificadas produzirem elevados níveis de IL-2 após a incubação com soro de paciente com criptococose. Os construtos 18B7-GXMR-CAR e 2H1-GXMR-CAR foram expressos em células NK-92 para investigar a capacidade de mediar um efeito fungicida e fungistático sobre leveduras de C. neoformans ou C. gattii, porém não foi observado uma redução do crescimento do fungo na presença das células NK-92 modificadas. Por outro lado, a expressão dos construtos de GXMR-CAR induziu uma produção significativa de IFN-γ pelas células NK-92 modificadas mesmo na ausência e presença de Cryptococcus spp., e o construto 2H1-GXMR-CAR se destacou como maior indutor da liberação de IFN-γ. Os mecanismos envolvidos na ausência de atividade fungicida de células NK-92 modificadas com GXMR-CAR sobre o Cryptococcus spp. estão sendo investigados, e os indícios direcionam para uma baixa liberação de grânulos de perforina pelas células NK-92 modificadas a partir do domínio de transdução de sinal adotado nos construtos de GXMR-CAR avaliados. Portanto, concluímos que ambos os scFv de 2H1 e 18B7, pertencentes ao GXMR-CAR, promovem um nível de ativação próximo nos diferentes tipos celulares modificados e incubados com o ligante, e indícios contundentes demonstram que a distinção na oligomerização do GXMR-CAR causada pelos diferentes scFv reflete na intensidade da sinalização tônica mediada por GXMR-CAR.

Invasive fungal infections represent a serious public health issue affecting more than one billion people worldwide, and Cryptococcus gattii and Cryptococcus neoformans are the main fungi that cause invasive infections and they affect immunocompetent and immunocompromised individuals, respectively. The annual mortality rate is estimated about 625,000 deaths from cryptococcosis. Cryptococcus spp. it presents several virulence factors that mediate the subversion of the host immune response, which fact is associated with a reduction in the microbicidal activity of phagocytic cells and an impairment of T cell differentiation into effector profiles against cryptococcosis. The polysaccharide capsule is the main virulence factor of Cryptococcus spp., which is composed mainly of GXM (glucuronoxylomannan), that masks the components of the fungal cell wall that can be recognized by immune cells. Antifungal therapy for the treatment of cryptococcosis leads to adverse side effects to the host and also increase the resistance of Cryptococcus spp. against antifungals. Thus, immunotherapies have been proposed in the treatment of cryptococcosis, and the cell therapy using T or NK cells modified with chimeric antigen receptor (CAR) is a promising therapeutic strategy against cryptococcosis. Previous studies have shown that the redirection of T cells expressing a CAR, which contain a specific recognition domain specific to Cryptococcus spp. GXM, were able to reduce the progression of cryptococcosis. Thus, the present work investigated the effect of distinct GXMR-CAR containing different scFv (single-chain variable domain), which were derived from 2H1 and 18B7 clones of monoclonal antibodies (mAb) specific for GXM, as components of the antigen recognition region of GXMR-CAR. The lentiviral vectors of the 18B7-GXMR-CAR and 2H1-GXMR-CAR constructs share the coding sequences for the hinge/transmembrane region (CD8 molecule) and the intracellular portion composed of the costimulatory molecule CD137 (4-1BB) accoupled to CD3ζ. GXMR-CAR and 2H1-GXMRCAR plasmids were cotransfected with pMD2 and pPAX2 into HEK-293T cells for the production of lentiviral particles targeting modification of Jurkat and NK-92 cells. Jurkat cells modified with 18B7-GXMR-CAR and 2H1-GXMR-CAR recognized soluble GXM from C. gattii (R265) and C. neoformans (H99), and these modified cells after incubation with soluble GXM or C. gattii and C. neoformans yeasts produced high levels of IL-2. Furthermore, Jurkat cells expressing 18B7-GXMR-CAR or 2H1-GXMR-CAR showed tonic signaling more pronounced after expression of 18B7-GXMR-CAR, and the cell activation mediated by GXMR-CAR constructs in the presence or absence of the ligand was dramatically mitigated after incubation with Dasatinib, a pharmacological inhibitor of protein kinases of the Src family. The different levels of the tonic signaling triggered by 18B7-GXMR-CAR had a strong association with the oligomerization on the cell surface caused by scFv of GXMR-CAR, as verified by fluorescence microscopy that demonstrated a high frequency of cluster of 18B7- GXMR-CAR whereas 2H1-GXMR-CAR had a distribution more homogeneous. The GXMRCAR constructs also mediated the activation of modified T cells after co-cultivation with clinical isolates of C. neoformans or C. gattii and, in addition, the modified cells produced high levels of IL-2 after incubation with serum from patient with cryptococcosis. The 18B7-GXMRCAR and 2H1-GXMR-CAR constructs were expressed in NK-92 cells to investigate its ability to mediate a fungicidal and fungistatic effect on C. neoformans or C. gattii yeasts, however the reduction of the growth of Cryptococcus spp. was not observed in the presence of modified NK-92 cells. On the other hand, the expression of the GXMR-CAR constructs induced a significant production of IFN-γ by NK-92 cells even in the absence or presence of Cryptococcus spp., and the 2H1-GXMR-CAR construct was the greatest inducer of IFN-γ. The mechanisms involved in the absence of fungicidal activity of NK-92 cells modified with GXMR-CAR over Cryptococcus spp. were initiated, and the first results evidence a low release of perforin granules by NK-92 cells modified due to the signal transduction domain used in the GXMR-CAR constructs. Therefore, we concluded that both scFv of 2H1 and 18B7, which were considered in the GXMR-CAR constructs, were able to promote a similar level of activation in different cell types modified after incubation with the ligand, and there are some points that justify the intensity of tonic signaling mediated by GXMRCAR due to the oligomerization grade of GXMRCAR constructs caused by distinct scFv evaluated.