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Disertación de Maestría
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2020.tde-08042021-081156
Documento
Autor
Nombre completo
Gabriela Yamazaki de Campos
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2020
Director
Tribunal
Silva, Thiago Aparecido da (Presidente)
Coelho, Paulo Sergio Rodrigues
Teixeira, David Nascimento Silva
Título en portugués
Efeito do agonista de TLR2-Pam3CSk4 em estratégia vacinal contra a infecção por Cryptococcus gattii
Palabras clave en portugués
Agonista de TLR2
Cryptococcus gattii
Imunomodulação
Vacina
Resumen en portugués
Criptococose é uma relevante infecção fúngica invasiva que afeta indivíduos imunossuprimidos e imunocompetentes quando causada por Cryptococcus gattii. Esse fungo tem a capacidade de escapar da resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro, bloqueando a diferenciação de células Th1 e Th17, que são relacionadas com resposta pró-inflamatória benéfica no controle da criptococose. Agonistas de TLR2 são importantes reguladores da resposta imune e têm sido utilizados como adjuvantes em vacinas contra infecções causadas por bactérias ou vírus. Logo, o presente trabalho visou avaliar o efeito imunomodulador do agonista de TLR2 (Pam3CSk4) como adjuvante em estratégia vacinal contra a infecção por C. gattii. Inicialmente, avaliamos o efeito imunomodulador de Pam3CSk4 em macrófago alveolar a partir da linhagem AMJ2-C11, e observamos a indução de uma resposta pró-inflamatória em resposta ao Pam3CSk4 que se manteve na presença de leveduras viáveis de C. gattii. O efeito imunomodulador de Pam3CSk4 elevou a atividade fagocítica de AMJ2-C11 frente a C. gattii, entretanto o efeito fungistático de AMJ2-C11 induzido por Pam3CSk4 não reduziu o crescimento de C. gattii. Em outro momento, avaliamos o efeito imunomodulador de Pam3CSk4 associado à imunização com leveduras inativadas de C. gattii no controle da criptococose experimental nos modelos murinos BALB/c e C57BL/6. No protocolo A de imunização, os camundongos BALB/c receberam três imunizações (7 dias de intervalo) contendo 1x105 leveduras inativadas em associação com 1 µg de Pam3CSk4 (Imunizado+P3C4). No período pós-imunização, observamos que as células esplênicas dos animais do grupo Imunizado+P3C4 estavam mais responsivas ao estímulo in vitro, no entanto, a avaliação do perfil da resposta imune no tecido pulmonar demonstrou a prevalência de um ambiente supressor causado pela administração de Pam3CSk4 associado à imunização. Esse achado repercutiu na ausência do controle da infecção por C. gattii através do protocolo A de imunização. Dessa forma, partimos para um protocolo B de imunização em que camundongos C57BL/6 receberam três imunizações (14 dias de intervalo) com 2x107 leveduras inativadas associadas com 1 µg ou 10 µg de Pam3CSk4 (Imunizado+P3C4-1µg ou Imunizado+P3C4-10µg), seguido pela infecção com C. gattii após 14 dias da etapa de imunização. Camundongos do grupo Imunizado+P3C4-1µg tiveram níveis reduzidos de IgG1, IgG2a e IgGA e nenhuma diferença significativa no título de IgG e IgM anti-GXM, comparado ao grupo Imunizado. Ainda sobre o grupo Imunizado+P3C4-1µg, observamos níveis elevados de IL-17 e IL-1β no pulmão, mas com ausência do predomínio de células Th17 diferenciadas. Além disso, a redução na expressão relativa de T-bet e aumento de Foxp3 sugerem que os animais do grupo Imunizado+P3C4-1µg tiveram uma prevalência de células T regulatórias no pulmão, o que não contribuiu no controle da infecção por C. gattii. Em relação aos animais imunizados em associação com 10µg de Pam3CSk4 foi detectado altos níveis de IL-17 no tecido pulmonar, no entanto citocinas de diferentes perfis apresentaram níveis reduzidos na ausência de um perfil de células T CD4+ definido. A frequente detecção de IL-17 no tecido pulmonar dos grupos Imunizado+P3C4 não promoveu uma redução da carga de C. gattii no pulmão, fato corroborado pela análise histopatológica que evidenciou maior comprometimento do parênquima pulmonar devido a extensão dos granulomas. Portanto, o efeito imunomodulador de Pam3CSk4, associado com a imunização, favoreceu uma resposta pró-inflamatória que não culminou em atividade efetora, isso se relaciona com um microambiente no tecido pulmonar com um perfil de resposta imune com característica supressora/regulatória induzido após a infecção com C. gattii.
Título en inglés
TLR2 agonist-Pam3CSk4 effect in vaccination strategy against Cryptococcus gattii infection
Palabras clave en inglés
Cryptococcus gattii
Immunomodulation
TLR2 agonist
Vaccine
Resumen en inglés
Cryptococcosis is a relevant invasive fungal infection that affects immunosuppressed and immunocompetent individuals when caused by Cryptococcus gattii. This fungus can escape the host's innate and adaptive immune response, blocking the differentiation of Th1 and Th17 cells, which are related to a beneficial pro-inflammatory response in the control of cryptococcosis. TLR2 agonists are important regulators of the immune response and have been used as adjuvants in vaccines against infections caused by bacteria or viruses. Therefore, this work aimed to evaluate the immunomodulatory effect of the TLR2 agonist (Pam3CSk4) as an adjuvant in vaccination strategy against C. gattii infection. Initially, we evaluated the immunomodulatory effect of Pam3CSk4 in alveolar macrophage cell line AMJ2-C11 and observed the induction of a pro-inflammatory response, caused by Pam3CSk4, which was maintained in the presence of viable C. gattii yeasts. The immunomodulatory effect of Pam3CSk4 increased the phagocytic activity of AMJ2-C11 against C. gattii, however the fungistatic effect of AMJ2-C11 induced by Pam3CSk4 did not reduce the growth of C. gattii. In another moment, we evaluated the immunomodulatory effect of Pam3CSk4 associated with inactivated yeasts of C. gattii immunization in the control of experimental cryptococcosis in murine models BALB/c and C57BL/6. In the immunization protocol A, BALB/c mice received three immunizations (7 days apart) containing 1x105 inactivated yeasts in association with 1 µg of Pam3CSk4 (Immunized+P3C4). In the post-immunization period, we observed that the splenic cells of the animals of the Immunized+P3C4 group were more responsive to the stimulus in vitro, however, the evaluation of the type of immune response in lung tissue demonstrated the prevalence of a suppressive environment caused by the administration of Pam3CSk4 associated with immunization. This finding reflected in the absence of control of infection by C. gattii through the immunization protocol A. Thus, we started an immunization protocol B in which C57BL/6 mice received three immunizations (14 days apart) with 2x107 inactivated yeasts associated with 1 µg or 10 µg of Pam3CSk4 (Immunized+P3C4-1µg or Immunized+P3C4-10µg ), followed by infection with C. gattii 14 days after the immunization stage. Mice from the Immunized+P3C4-1µg group had reduced levels of IgG1, IgG2a and IgGA and no significant difference in the IgG and IgM anti-GXM titer, compared to the Immunized group. Still on the Immunized+P3C4-1µg group, we observed high levels of IL-17 and IL-1%beta; in lung tissue but lacking a predominance of differentiated Th17 cells. In addition, the reduction in the relative expression of T-bet and increase in Foxp3 suggest that the animals of the Immunized+P3C4-1µg group had a prevalence of regulatory T cells in lung tissue, which did not contribute to the control of C. gattii infection. Regarding to animals immunized in association with 10 µg of Pam3CSk4, high levels of IL-17 were detected in lung tissue, however different types of cytokines showed reduced levels in the absence of a defined CD4+ T cell profile. The detection of IL-17 in the lung tissue of the Immunized+P3C4 groups did not promote a reduction in C. gattii burden, a fact corroborated by the histopathological analysis that revealed considerable damage of the lung parenchyma due to the extension of the granulomas. Therefore, the immunomodulatory effect of Pam3CSk4, associated with immunization, favored a pro-inflammatory response that did not culminate in a protective activity, and this is related to a microenvironment in the lung tissue with an immune response profile with a suppressive/regulatory characteristic induced after infection with C. gattii.
 
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Fecha de Publicación
2021-04-16
 
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