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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2020.tde-08042021-080730
Document
Author
Full name
Bruno Rafael Barboza
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2020
Supervisor
Committee
Silva, Thiago Aparecido da (President)
Beltrão, Eduardo Isidoro Carneiro
Traina, Fabíola
Title in Portuguese
Efeito da lectina ArtinM em células B de origem murina e células de linhagem humana de linfoma não-Hodgkin
Keywords in Portuguese
ArtinM
Células B
Imunomodulação
Lectina
Linfoma de Burkitt
Reconhecimento de carboidrato
Abstract in Portuguese
A lectina ArtinM, obtida a partir do extrato salino de sementes de Artocarpus heterophyllus (jaca), é caracterizada estruturalmente como um homotetrâmero de subunidades de 16 kDa, cada uma delas constituída por um CRD com sítio de ligação primária para Manα1-3[Manα1- 6]Manβ1-4, estrutura presente no core de N-glicanas. ArtinM induz a ativação de mastócitos (via interação com FcεRI), neutrófilos (via interação com CXCR2/TLR2), macrófagos (via interação com TLR2/CD14), e a ativação de células T CD4+ e T CD8+ (via interação com a cadeia gamma de CD3). A atividade imunomoduladora de ArtinM sobre essas células resulta em um perfil pró-inflamatório com a capacidade de combater infecções por patógenos intracelulares. Recentemente, células B murinas foram incluídas como alvos de ArtinM que induziu a produção de IL-17 e IL-12p40 nesse tipo celular, de maneira independente do reconhecimento de TLR2/CD14. Com isso, o presente estudo buscou caracterizar os efeitos da lectina ArtinM sobre células B de origem murina e linhagens celulares humanas de linfoma não-Hodgkin, ressaltando os mecanismos moleculares induzidos após o reconhecimento de carboidratos. Inicialmente, células B murinas purificadas de camundongos C57Bl/6 foram incubadas com diferentes concentrações de ArtinM (0,312 - 5,0 μg/mL), e a lectina não induziu a proliferação celular e baixos níveis de IL-2, IFN-ϒ e IL-12 foram produzidos pelas células B. No entanto, as concentrações da lectina testadas, com destaque para as altas concentrações, induziram a apoptose de células B murinas. Portanto, ArtinM não apresenta um efeito imunomodulador em células B que direciona uma resposta imune associada ao perfil Th1. Por conseguinte, o efeito citotóxico da lectina sobre células B originadas de linfoma não-Hodgkin foi avaliado, a partir das linhagens celulares Raji e Daudi. Ao explorar o efeito de ArtinM nessas linhagens celulares, observamos a capacidade de ArtinM em reduzir o crescimento e a viabilidade celular com intensidade diferente para cada tipo celular, com efeito citotóxico mais pronunciado nas células Raji. Assim, ao aprofundar a avaliação do efeito citotóxico de ArtinM em células Raji, verificamos a ausência da fragmentação de DNA e um contundente indicativo da exclusão da cascata de apoptose via mitocondrial e moléculas sinalizadoras da via de autofagia. Com isso, possíveis moléculas de sinalizadoras envolvidas no efeito citotóxico de ArtinM sobre células de linfoma não-Hodgkin foi investigado com o uso de inibidores farmacológicos específicos para PKC, PTK, atividade fosfatase de CD45 sobre Lck, e quinases da família Src. Essa abordagem implicou que a indução da apoptose por ArtinM em células Raji está relacionada com os seguintes mecanismos moleculares, como: (i) PTK e PKC regulam negativamente a indução da apoptose em células Raji por ArtinM; (ii) a atividade de fosfatase de CD45 sobre Lck regula negativamente o efeito citotóxico de ArtinM em células Raji; (iii) quinases da família Src regulam de forma positiva a indução da apoptose de células Raji por ArtinM. Portanto, ArtinM apresenta um efeito citotóxico em linhagens de células B de linfoma não-Hodgkin. O presente trabalho demonstra as limitações do efeito imunomodulador de ArtinM em células B murinas, e cria uma importante área investigativa no campo terapêutico frente a células de linfoma não-Hodgkin através do reconhecimento de carboidratos.
Title in English
Effect of ArtinM in murine B cells and human cell lines derived from non-Hodgkin lymphoma
Keywords in English
ArtinM
B cells
Burkitt's lymphoma
Carbohydrate recognition
Cell death
Immunomodulation
Abstract in English
The ArtinM lectin, obtained from the saline extract of seeds of Artocarpus heterophyllus (jackfruit), is structurally characterized as a homotetramer of 16 kDa subunits, each each consisting of a CRD with primary binding site for Manα1-3[Manα1-6]Manβ1-4, structure present in the N-glycans core. ArtinM induces mast cell activation (via interaction with FcεRI), neutrophils (via interaction with CXCR2/TLR2), macrophages (via interaction with TLR2/CD14), and activation of CD4+ T and CD8+ T cells (via interaction with the gamma chain of CD3). The immunomodulatory activity of ArtinM on these cells results in a proinflammatory profile with the ability to combat infections by intracellular pathogens. Recently, murine B cells were included as targets of ArtinM that induced the production of IL-17 and IL- 12p40 in that cell type, independently manner of TLR2/CD14 recognition. Thus, the present study sought to characterize the effects of ArtinM in murine B cells and human non-Hodgkin lymphoma cell lines, highlighting the molecular mechanisms induced after carbohydrate recognition. Initially, murine B cells purified from C57BL/6 mice were incubated with different concentrations of ArtinM (0.312 - 5.0 μg/mL), and lectin did not induce cell proliferation and low levels of IL-2, IFN-ϒ and IL-12 were produced by B cells. However, the lectin concentrations tested, with emphasis on high concentrations, induced apoptosis of murine B cells. Therefore, ArtinM does not have an immunomodulatory effect on B cells that directs an immune response associated with the Th1 profile. Therefore, the cytotoxic effect of lectin on B cells originating from non-Hodgkin's lymphoma was evaluated, from the cell lines Raji and Daudi. When exploring the effect of ArtinM on these cell lines, we observed the ability of ArtinM to reduce cell growth and viability with different intensity for each cell type, with a more pronounced cytotoxic effect on Raji cells. Thus, when deepening the evaluation of the cytotoxic effect of ArtinM in Raji cells, we verified the absence of DNA fragmentation and a strong indication of the exclusion of the apoptosis cascade via mitochondrial and signaling molecules of the autophagy pathway. Thus, possible signaling molecules involved in the cytotoxic effect of ArtinM in non-Hodgkin's lymphoma cells were investigated with the use of specific pharmacological inhibitors for PKC, PTK, CD45 phosphatase activity in Lck, and kinases of Src family. This approach implied that the induction of apoptosis by ArtinM in Raji cells is related to the following molecular mechanisms, such as: (i) PTK and PKC downregulate the induction of apoptosis in Raji cells by ArtinM; (ii) the phosphatase activity of CD45 in Lck down-regulate the cytotoxic effect of ArtinM in Raji cells; (iii) Src kinases regulate positively the induction of Raji cell apoptosis by ArtinM. Therefore, ArtinM has a cytotoxic effect in non-Hodgkin's lymphoma B cell lines. The present work demonstrates the limitations of the immunomodulatory effect of ArtinM in murine B cells, and creates an important investigative area in the therapeutic field against non-Hodgkin's lymphoma cells through the recognition of carbohydrates.
 
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Publishing Date
2021-04-16
 
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