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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2021.tde-07022022-124115
Documento
Autor
Nombre completo
Yunan Costa Januário
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2021
Director
Tribunal
Silva, Luis Lamberti Pinto da (Presidente)
Espreafico, Enilza Maria
Ferrari, Merari de Fatima Ramires
Ferreira, Sergio Teixeira
Título en portugués
Caracterização funcional de AP-1 e Arc/Arg3.1 no transporte e processamento de APP na via secretória tardia
Palabras clave en portugués
Alzheimer
AP-1
APP
Arc/Arg3.1
Endossomos
Golgi
Via secretória
Resumen en portugués
A doença de Alzheimer é um tipo comum de demência causada por degeneração e morte neuronal. Uma das características histopatológicas desta doença é o acúmulo de peptídeos tóxicos β-amiloide (Aβ) no espaço extracelular, contribuindo para a formação das placas senis. O precursor direto de Aβ é o fragmento carboxi-terminal (CTFβ ou C99) da proteína precursora do beta-amiloide (APP). O C99 é detectado em níveis elevados no cérebro com Alzheimer e seu acúmulo intracelular foi relacionado à neurotoxicidade precoce, independentemente de Aβ. A clivagem proteolítica de APP em C99 ocorre durante seu transporte na via secretória. No entanto, as causas para o aumento dos níveis celulares de C99 são pouco compreendidas. Neste trabalho objetivou-se estudar a participação da proteína adaptadora 1 (AP-1) e de Arc/Arg3.1 no transporte e processamento de APP na via secretória tardia. Ensaios de imunoprecipitação e duplo híbrido mostraram que AP-1 interage com a APP e esta interação requer o domínio conservado 682YENPTY687 na cauda citosólica de APP e dois locais de ligação na subunidade µ1A de AP-1. Para entender a importância de AP-1 no transporte de APP utilizou-se ensaios de imunofluorescência e microscopia confocal realizados em células de linhagem humana (HeLa e H4) ou cultura primária de neurônios de rato. As análises foram realizadas empregando técnicas de silenciamento por RNAi, uso de células com gene deletado por CRISPR/Cas9 combinado com o resgate da expressão, expressão de dominante negativo e a expressão de um mutante de APP deficiente na interação com AP-1. A observação dos dados mostrou que AP-1 é essencial para transferir APP do complexo de Golgi para os endossomos. A interferência no transporte mediado por AP-1 leva a retenção de APP na rede trans-Golgi. Para analisar o processamento de APP e geração do fragmento C99 em células HeLa foi utilizado o ensaio de western blot com uso da ferramenta de transporte sincronizado na via secretória com Retention Using Selective Hooks (RUSH). O bloqueio no transporte de APP mediado por AP-1 reduz a cinética de geração de C99, mas leva ao aumento dos níveis intracelulares de C99 no estado de equilíbrio da distribuição subcelular de APP. Os resultados indicam que AP-1 controla diretamente a distribuição subcelular de APP de forma a regular a geração e o acúmulo intracelular do fragmento patogênico C99. Isso indica que os defeitos no transporte de APP/C99 mediado por AP-1 podem ser um fator potencial que contribui para o desenvolvimento da doença de Alzheimer. Em conjunto com estes resultados também foi estudado a participação da proteína Arc/Arg3.1 no transporte e processamento de APP. Arc é uma proteína que controla a plasticidade neuronal e cuja atividade foi anteriormente relacionada ao acúmulo de Aβ. Ensaios de western blot em células H4 mostraram que a expressão de Arc aumenta os níveis de APP e todos os seus fragmentos carboxi-terminais (CTFs), incluindo o fragmento C99. O uso de uma droga que inibe a atividade lisossomal mostrou que Arc favorece a geração do fragmento C99. Além disso, ensaios de imunofluorescência e microscopia confocal indicaram que Arc favorece o acúmulo de APP no sistema endossomal. Como tentativa de elucidar o possível mecanismo pelo qual Arc controla o transporte intracelular de APP na via secretória tardia foi analisado se Arc interage com as proteínas adaptadoras de vesículas (APs). Foi observado por ensaio de imunoprecipitação e ensaio de duplo híbrido que Arc interage eficientemente com a subunidade média µ de AP1, AP-2, AP-3 e AP-4. Estes dados mostram que Arc interfere no trânsito endolisossomal de APP levando ao aumento do fragmento C99 e que é capaz de interagir com diferentes APs, sendo esta a base de um possível mecanismo pelo qual Arc regula o transporte de APP.
Título en inglés
Functional characterization of AP-1 and Arc/Arg3.1 in the transport and processing of APP at the late secretory pathway
Palabras clave en inglés
Alzheimer
AP-1
APP
Arc/Arg3.1
Endosomes
Golgi
Secretory pathway
Resumen en inglés
Alzheimer's disease is a common type of dementia caused by neuronal degeneration and death. A hallmark of this disease in the brain is the accumulation of toxic amyloid-β (Aβ) peptides in the extracellular space, contributing to the formation of senile plaques. The direct precursor of Aβ is the carboxy-terminal fragment (CTFβ or C99) of the amyloid-beta precursor protein (APPβ). C99 is detected at high levels in the brain with Alzheimer's disease and its intracellular accumulation has been linked to early neurotoxicity, independently of Aβ. The proteolytic cleavage of APP at C99 occurs during its transport in the secretory pathway. However, the causes for the increased cellular levels of C99 are poorly understood. This work aimed to study the participation of adaptor protein 1 (AP-1) and Arc/Arg3.1 in the transport and processing of APP at the late secretory pathway. Immunoprecipitation and yeast two-hybrid assays showed that AP-1 interacts with APP. This interaction requires the conserved domain 682YENPTY687 in the cytosolic tail of APP and two binding sites in the µ1A subunit of AP-1. To understand the AP-1 importance in the APP transport, immunofluorescence and confocal microscopy assays were performed in human cell lines (HeLa and H4) or primary rat neurons. Analyzes were performed using RNAi silencing techniques, CRISPR/Cas9 gene deleted cells combined with the rescue of expression, dominant-negative expression and the expression of an APP mutant deficient in the interaction with AP-1. Observation of the data revealed that AP-1 is essential for transferring APP from the Golgi complex to endosomes. Interference with AP-1-mediated transport leads to APP retention in the trans-Golgi network. To analyze APP processing and C99 fragment generation in cells, we used western blot assays using the synchronized transport tool in the secretory pathway with Retention Using Selective Hooks (RUSH). Delaying APP transport in AP-1 deleted cells reduces C99 generation kinetics. Interestingly, at the stead state of APP subcellular distribution, the intracellular levels of C99 were increased upon AP-1 depletion. Our results indicate that AP-1 directly controls the subcellular distribution of APP in a way that regulates the generation and intracellular accumulation of the pathogenic C99 fragment. This indicates that defects in AP-1-mediated transport of APP/C99 may be a potential contributing factor to Alzheimer's disease. Together with these results, the participation of the Arc/Arg3.1 protein in the transport and processing of APP was also studied. Arc is a protein that controls neuronal plasticity and whose activity was previously related to Aβ accumulation. Western blot assays in H4 cells show that Arc expression increases APP levels and all of its carboxy-terminal fragments (CTFs), including the C99 fragment. The use of a drug that inhibits lysosomal activity showed that Arc favors the generation of the C99 fragment. Immunofluorescence and confocal microscopy assays indicated that Arc favors the accumulation of APP in the endosomal system. In an attempt to elucidate the possible mechanism by which Arc controls the intracellular transport of APP in the late secretory pathway, was analyzed whether Arc interacts with vesicle adapter proteins (APs). It was observed by immunoprecipitation and yeast two-hybrid assay that Arc interacts with the mediu µ subunit of AP1, AP-2, AP-3 and AP-4. These data indicated that Arc alters APP endolysosomal transit, leading to an increase in the C99 fragment and interacts with different APs as a possible mechanism by which Arc regulates APP transport.
 
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Fecha de Liberación
2023-11-04
Fecha de Publicación
2022-02-16
 
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