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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2021.tde-07022022-123632
Documento
Autor
Nome completo
Lays Adrianne Mendonça Trajano Silva
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2021
Orientador
Banca examinadora
Baqui, Munira Muhammad Abdel (Presidente)
Júnior, Lucio Holanda Gondim de Freitas
Cruz, Angela Kaysel
Silva, Narcisa Leal da Cunha e
Título em português
Caracterização funcional das proteínas gigantes tipo calpaína-like presentes na região do FAZ de Trypanosoma cruzi usando o sistema CRISPR/Cas9
Palavras-chave em português
Citoesqueleto
CRISPR/Cas9
Proteínas gigantes
Trypanosoma cruzi
Resumo em português
O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, é um protozoário unicelular que possui características biológicas e genômicas únicas. Atualmente, dois medicamentos possuem eficácia comprovada apenas na fase aguda da doença, e por não existir vacinas, a busca por métodos que possibilitem novas terapêuticas são necessárias. Neste contexto, o estudo da biologia do parasito contribui para elucidar mecanismos pelo qual o T. cruzi consegue sobreviver aos mais variados ambientes, e desta forma identificar alvos que podem ser utilizados como vias terapêuticas. Na família Trypanosomatidae foi descrita a presença de proteínas de alta massa molecular localizadas na Zona de Adesão Flagelar (FAZ) com papel importante na manutenção da forma, organização e proliferação celular. Neste contexto, proteínas gigantes (PGs) foram identificadas na região do FAZ em tripanossomatídeos, sendo caracterizadas principalmente em T. brucei. No entanto, em T. cruzi as PGs permanecem não caracterizadas. Através de espectrometria de massas (MS), identificamos seis proteínas de alta massa molecular presentes na fração do citoesqueleto de T. cruzi. Com 18 hits, a proteína gigante tipo Calpaina-like cisteína peptidase (denominada de ClpGP), de 13.716pb, presente no cromossomo 39, haplótipo Non-Esmeraldo-like do T. cruzi CL Brener, foi escolhida para seguir com os estudos funcionais. Portanto, este projeto teve como objetivo de caracterizar o papel funcional da ClpGP presente no citoesqueleto de T. cruzi. Para analisar a distribuição da ClpGP no T. cruzi CL Brener epimastigota, produzimos anticorpos específicos utilizando a proteína recombinante e um peptídeo sintético, ambos construídos na região N-terminal da proteína. As análises por microscopia confocal demonstraram a localização desta proteína na região do FAZ, na porção do corpo celular, denominado de domínio FAZ intracelular. Com a recente utilização do sistema de edição gênica por CRISPR/Cas9 em tripanossomatídeos, tornou-se possível o estudo funcional de proteínas em T. cruzi. O RNA guia (sgRNA) desenhado para a ClpGP também reconheceu quatro genes de Clp presentes no cromossomo 39, mas no haplótipo Esmeraldo-like. A estratégia utilizada neste estudo foi capaz de promover a edição dos cinco genes presentes nos dois haplótipos de T. cruzi CL Brener de uma única vez. O nocaute dos genes da Clp no T. cruzi, forma epimastigota, promoveu um encurtamento do corpo celular, produzindo formas semelhantes a promastigota. Além disso, foi observado mudanças na organização celular, acúmulo de microtúbulos subpeliculares e defeitos no bolso flagelar. As modificações após o nocaute não afetaram a proliferação celular dos parasitas mutantes, quando comparados ao controle. Usando o anticorpo anti-TcFAZ, que reconhece um grupo de PGs (acima de 1000kDa) presentes no FAZ, observamos que o mutante não apresenta marcação na região do FAZ em ensaios de microscopia confocal e nem por western blotting. A edição de cinco genes alvos, pertencentes a mesma família de proteínas, é inédito em tripanossomatídeos. Nossos resultados sugerem que as Clps podem ter um papel na manutenção e organização celular da forma epimastigota em T. cruzi. Também nossos dados indicam que as Clps podem estar envolvidas na mudança de forma do parasita durante o ciclo de vida, podendo ter um papel chave na adaptação e sobrevivência do parasita em seus hospedeiros. Estes achados podem fornecer respostas sobre o modo de vida do T. cruzi e poderá futuramente auxiliar no desenvolvimento de novas drogas alvos para combater à doença.
Título em inglês
Functional characterization of Calpain-like giant proteins at the FAZ region of Trypanosoma cruzi by CRISPR/Cas9 system
Palavras-chave em inglês
CRISPR/Cas9
Cytoskeleton
Giant proteins
Trypanosoma cruzi
Resumo em inglês
Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease, is a unicellular protozoan with unique biological and genomic characteristics. Currently, two drugs have proven efficacy only in the acute phase of the disease, and as there are no vaccines, the search for methods that enable new therapies is necessary. In this context, the study of the parasite's biology contributes to elucidate the mechanisms by which T. cruzi survives in the most varied environments and thus identify targets that can be used as therapeutic pathways. In the Trypanosomatidae family, the presence of high molecular mass proteins located in the Flagellar Adhesion Zone (FAZ) has been described, with an essential role in the maintenance of cell shape, organization, and proliferation. In this context, giant proteins (GPs) were identified in the FAZ region in trypanosomatids, being characterized mainly in T. brucei. However, in T. cruzi, the GPs remain uncharacterized. Through mass spectrometry (MS), we identified six high molecular mass proteins present in the cytoskeletal fraction of T. cruzi. With 18 hits, the giant protein Calpain-like cysteine peptidase (called ClpGP), of 13,716bp, present on chromosome 39 in Non-Esmeraldo-like haplotype of T. cruzi CL Brener, was chosen to continue with the functional studies. Therefore, this project aimed to characterize the functional role of ClpGP present in the cytoskeleton of T. cruzi. To analyze the distribution of ClpGP in the T. cruzi CL Brener epimastigote, we produced specific antibodies using the recombinant protein and a synthetic peptide, both built in the N-terminal region of the protein. Analysis by confocal microscopy demonstrated the location of this protein in the FAZ region, in the portion of the cell body, called the intracellular FAZ domain. With the recent use of the CRISPR/Cas9 gene editing system in trypanosomatids, the functional study of proteins in T. cruzi became possible. The guide RNA (sgRNA) designed for ClpGP also recognized four Clp genes present on chromosome 39 but in the Esmeraldo-like haplotype. The strategy used in this study was able to promote the editing of the five genes present in the two T. cruzi CL Brener haplotypes at once. The knockout of the Clp genes in T. cruzi, an epimastigote form, caused a shortening of the cell body, producing promastigote-like forms. Furthermore, changes in cell organization, accumulation of subpellicular microtubules, and defects in the flagellar pocket were observed. However, the modifications after the knockout did not affect the cell proliferation in the mutant parasites compared to the control. Using the anti-TcFAZ antibody, which recognizes a group of GPs (above 1000kDa) present in the FAZ, we observed that the mutant does not present labeling in the FAZ region in the confocal microscopy assays or by western blotting. The editing of five target genes belonging to the same protein family is unprecedented in trypanosomatids. Our results suggest that Clps may play a role in maintaining and cellular organization of the epimastigote form in T. cruzi. Our data also indicate that Clps may present function in in the parasite morphology during the life cycle and may play a key role in its host adaptation and survival. These findings may provide answers about the way of life of T. cruzi and may help in the development of new target drugs to fight the disease.
 
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Data de Liberação
2023-12-08
Data de Publicação
2022-02-18
 
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