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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2021.tde-07022022-122756
Documento
Autor
Nome completo
Cleidy Mirela Osorio Mogollón
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2021
Orientador
Banca examinadora
Baqui, Munira Muhammad Abdel (Presidente)
Thiemann, Otavio Henrique
Ward, Richard John
Título em português
Determinação estrutural da proteína FAZ10 e caracterização dos seus parceiros moleculares na Zona de Adesão Flagelar em Trypanosoma brucei
Palavras-chave em português
Citoesqueleto
Estrutura molecular
FAZ10
Interação
Trypanosoma brucei
Zona de Adesão Flagelar
Resumo em português
A Tripanossomíase Humana Africana - HAT, também chamada Doença do sono, é uma doença parasitaria, cujo agente etiológico é o parasita unicelular flagelado Trypanosoma brucei e é endêmica dos países da África subsaariana. Os sintomas comuns são: febres, forte dor de cabeça, extrema fatiga e interrupção do padrão de sono. Se não é tratada a tempo esta doença pode ocasionar a morte algumas semanas depois da infeção. A pesar dos grandes esforços em novas terapias e controle epidemiológico para erradicar a doença do sono, 60 milhões de pessoas no Continente Africano estão ainda em risco de contrair a doença segundo os dados atuais da Organização Mundial da Saúde. A morfologia do parasita T. brucei consiste de um corpo celular e um único flagelo aderido ao corpo na chamada Zona de Adesão Flagelar (FAZ). O FAZ é responsável da união, estabilização do flagelo com o corpo celular, na morfogênese e sobrevivência do parasita. Esta zona é formada por um complexo de proteínas, incluindo, a FAZ10 (Tb927.07.3330) uma proteína de alta massa molecular (~2000 kDa) que demonstramos ser essencial para a correta formação do sulco de clivagem e da divisão celular. No entanto, pouco se conhece sobre sua estrutura e de suas interações com outras proteínas no FAZ. Neste contexto, o objetivo desta dissertação foi analisar e propor um modelo estrutural da proteína FAZ10. Além disto, identificar seus parceiros moleculares na região de adesão flagelar. Foram utilizadas ferramentas de bioinformática, como servidores de análises de sequência (ELM, IUPred2A) e preditores de modelos como AlphaFold2 para determinação da sua estrutura. Também realizamos o silenciamento da FAZ10 por RNAi, análise por RT-qPCR, western blot (WB) e Imunofluorescência (IF), além de espectrometria de massas (MS). Pela primeira vez, está sendo apresentado a estrutura de uma proteína da região do FAZ. A FAZ10 foi analisada por regiões devido ao seu tamanho e observamos uma região central com presença de coiled-coil orientada no sentido antiparalelo, a qual é responsável pelo dobramento da proteína. A análise por espectrometria de massas das proteínas parceiras da FAZ10 revelou inúmeras proteínas do FAZ que já foram validadas em outros estudos mostrando interagir com a FAZ10. Através de RT-qPCR, western blotting e imunofluorescência verificamos uma redução nos níveis gênicos e proteicos de ClpGM6, MORN, FAZ2 e FLAM3 quando a FAZ10 está silenciada. A compreensão da estrutura da FAZ10 em T. brucei e a identificação de seus parceiros, auxilia no entendimento da formação e interação entre os componentes do FAZ. Desta maneira, compreenderemos melhor a biologia do parasita a fim de identificar novos alvos terapêuticos.
Título em inglês
Structural determination of FAZ10 protein and characterization of its molecular partners in the Flagellum Attachment Zone (FAZ) in Trypanosoma brucei
Palavras-chave em inglês
Cytoskeleton
FAZ10
Flagellum Attachment Zone
Interaction
Molecular structure
Trypanosoma brucei
Resumo em inglês
Human African Trypanosomiasis: HAT, also called Sleeping Disease, is a parasitic disease endemic to sub-Saharan Africa. Its etiologic agent is the flagellate unicellular parasite Trypanosoma brucei. Common symptoms are fever, severe headache, extreme fatigue, and disruption of sleep patterns. If not treated in time, this disease can lead to death a few weeks after the infection. According to current data from the World Health Organization, despite significant efforts in new therapies and epidemiological control to eradicate sleeping sickness, 60 million people on the African continent are still at risk of contracting the disease. The morphology of the T. brucei parasite consists of a cell body and a single flagellum attached to the body in the so-called Flagellar Adhesion Zone (FAZ: Flagellum Attachment Zone). The FAZ is responsible for union, stabilization of the flagellum with the cell body in the morphogenesis, and survival of the parasite. This zone is a complex of proteins, including FAZ10 (Tb927.07.3330), a high molecular mass protein (~2000 kDa) that we have shown to be essential for the correct formation of the cleavage groove and cell division. Little is known about its structure and its interactions with other proteins in FAZ. In this context, this dissertation aimed to analyze and propose a structural model of the FAZ10 protein. Furthermore, identify their molecular partners in the flagellar adhesion region. Bioinformatics tools such as sequence analysis servers (ELM, IUPred2A) and model predictors such as AlphaFold2 were used to determine its structure. We also performed FAZ10 silencing by RNAi, analysis by RT-qPCR, western blot (WB), and Immunofluorescence (IF), in addition to mass spectrometry (MS). For the first time, the structure of a protein in the FAZ region is being presented. We modeled FAZ10 by regions due to its large size. We observed a central region with the presence of antiparallel coiled-coil, which is responsible for protein folding. After analysis by mass spectrometry, revealed numerous FAZ proteins were validated by RT-qPCR under wild-type conditions and after induction by RNAi. The data showed a reduction in ClpGM6, MORN, FAZ2, and FLAM3 genes when FAZ10 is silenced. Furthermore, these proteins have already been validated in other studies showing that they interact with FAZ10. We also analyzed the behavior of these proteins when FAZ10 is silenced in western blotting and immunofluorescence assays, revealing an alteration in the expression of these proteins. The knowledge of the FAZ10 structure in T. brucei and their partners identification help to understand the formation of the FAZ and the interaction between FAZ elements. In this way, we will better understand the biology of the parasite in order to identify new therapeutic targets.
 
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Data de Liberação
2025-12-03
Data de Publicação
2022-02-16
 
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