As bactérias Gram-negativas têm múltiplos sistemas de secreção para transportar proteínas através do envelope celular. O sistema de secreção do tipo I (T1SS) é um translocador tripartite formado por transportador ABC, proteína de fusão de membrana (MFP) e proteína de membrana externa (OMP). Dentre os substratos secretados por T1SS, as proteínas RTX ligadoras de cálcio podem ser toxinas ou adesinas envolvidas na relação de bactérias com hospedeiros. Neste trabalho, estudamos os T1SSs e as proteínas RTX de Chromobacterium violaceum, uma β-proteobactéria Gram-negativa encontrada no solo e na água que pode causar doença grave em humanos. Por meio da análise in silico, identificamos quatro clusters de genes que codificam T1SSs em C. violaceum. Em três desses clusters, encontramos genes que codificam seus substratos putativos, três grandes proteínas RTX. Construímos linhagens mutantes nulas sem as proteínas ABC/MFP (mutantes ΔT1SS) ou sem as proteínas RTX (mutantes ΔRTX). Ensaios de curvas de crescimento, viabilidade celular, hemólise e virulência em camundongos demonstraram que todas as linhagens mutantes se comportam de maneira semelhante à linhagem WT, indicando que estes genes não influenciam no fitness, na atividade hemolítica e na virulência de C. violaceum. Ensaios temporais de formação do biofilme e de agregação celular revelaram que os mutantes ΔCV_0311 e ΔCV_0306/07 apresentam redução na formação de biofilme e de agregados celulares na fase inicial de cultivo, indicando que a proteína RTX CV_0311 e seu T1SS CV_0306/07/08 desempenham papel importante na adesão célula-célula e célula-superfície abiótica na iniciação do biofilme. Demostramos por análises de SDS-PAGE e espectrometria de massa que a proteína CV_0311 é uma adesina RTX gigante de C. violaceum secretada exclusivamente pelo T1SS CV0306/07/08 em alta densidade celular, uma vez que tal proteína não foi detectada em sobrenadantes dos mutantes ΔCV_0311 e ΔCV_0306/07 nem no sobrenadante da linhagem WT em baixa densidade celular. Além disso, nossos dados indicam que o cálcio é necessário para agregação celular, provavelmente por auxiliar na função da proteína CV_0311, uma vez que a restrição desse íon causou diminuição da agregação celular na linhagem WT. Em conjunto, nossos dados apoiam um modelo em que a adesina RTX gigante CV_0311 é secretada pelo T1SS CV_0306/07/08, mas fica ancorada na superfície da célula em baixa densidade celular mediando formação de biofilme por atuar em adesão célula-célula e célula-substrato abiótico, sendo liberada apenas em alta densidade celular para o meio externo.

Gram-negative bacteria have multiple secretion systems for the transport of proteins across the cell envelope. The type I secretion system (T1SS) is a tripartite translocator formed by ABC transporter, membrane fusion protein (MFP), and outer membrane protein (OMP). Among the substrates secreted by T1SS, the calcium-binding RTX proteins can act as toxins or adhesins, which play key roles in the relationship of bacteria with hosts. In this work, we studied the T1SSs and RTX proteins from Chromobacterium violaceum, a Gram-negative β-proteobacterium found in soil and water that can cause severe disease in humans. Through in silico analysis, we identified four gene clusters that encode T1SSs in C. violaceum. In three of these clusters, we found genes encoding their putative substrates, three large RTX proteins. We constructed null mutant strains without the ABC/MFP proteins (ΔT1SS mutants) or without the RTX proteins (ΔRTX mutants). Assays of growth curves, cell viability, hemolysis, and virulence in mice showed that all mutant strains behave similarly to the WT strain, indicating that these genes do not influence the fitness, hemolytic activity, and virulence of C. violaceum. Temporal assays of biofilm formation and cell aggregation revealed that the mutants ΔCV_0311 and ΔCV_0306/07 show a reduction in the formation of biofilm and cell aggregates in the initial phase of cultivation, indicating that the protein RTX CV_0311 and its T1SS CV_0306/07/08 play important role in cell-cell and cell-surface adhesion in the step of biofilm initiation. We demonstrated by SDS-PAGE and mass spectrometry analysis that the CV_0311 protein is a giant RTX adhesin from C. violaceum secreted exclusively by the T1SS CV0306/07/08 at high cell density, since this protein was not detected in supernatants of the mutants ΔCV_0311 and ΔCV_0306/07 nor in the WT strain supernatant at low cell density. Furthermore, our data indicate that calcium is necessary for cell aggregation, probably because it aids in the function of the CV_0311 protein, since the restriction of this ion caused a decrease in cell aggregation in the WT strain. Taken together, our data support a model in which the giant RTX adhesin CV_0311 is secreted by the T1SS CV_0306/07/08, but remains anchored to the cell surface at low cell density mediating biofilm formation by acting on cell-cell and cell-substrate adhesion, being released only in high cell density to the external environment.