Vesículas de membrana externa (OMVs) sao nanopartículas esféricas (20-300 nm) liberadas naturalmente para o meio extracelular a partir da membrana externa de bactérias Gram-negativas. Estudos recentes indicam que as OMVs sao importantes tanto na fisiologia quanto nas interacoes bactéria-bactéria e bactéria-hospedeiro, atuando em patogênese, reposta bacteriana a diversos estresses e homeostase da microbiota humana. Neste trabalho, estudamos as vias de biogênese, a composição proteica, a seleção de carga e o papel in vivo das OMVs de Chromobacterium violaceum, um bacilo Gram-negativo ubíquo de vida-livre, que também é capaz de invadir e replicar-se em células eucarióticas. Quanto à biogênese de OMVs em C. violaceum, identificamos três mecanismos distintos, sendo estes mediados pelo sistema de transporte de fosfolipídios VacJ/YrbBCDEF, pela proteína periplasmática DsbA que auxilia no dobramento e estabilidade de proteínas secretadas e pela molécula hidrofóbica antimicrobiana violaceína. Demonstramos que a violaceína controla a vesiculação de C. violaceum ao induzir a sua própria secreção via OMVs, dessa forma promovendo a adaptação de C. violaceum frente à competição contra bactérias Gram-positivas. A taxa de vesiculação de C. violaceum foi controlada por quorum sensing via regulação da síntese de violaceína e do sistema VacJ/Yrb. O sistema VacJ/Yrb apresentou papel fundamental na homeostase da vesiculação e na manutenção da virulência de C. violaceum. Mutantes nulos sem os genes vacJ ou yrbE foram incapazes de invadir células epiteliais e foram completamente atenuados quanto à virulência em modelo murino, apesar de não apresentarem problemas fisiológicos e morfológicos, como demonstramos em ensaios fenotípicos e de microscopia eletrônica. Dessa maneira, estes dados favorecem um modelo no qual o aumento descontrolado da vesiculação é prejudicial para a manutenção de mecanismos de virulência que C. violaceum utiliza durante a invasão de células eucarióticas para o estabelecimento de seu nicho intracelular. Por fim, descobrimos neste trabalho que a proteína DsbA é muito importante para o endereçamento e qualidade de proteínas em OMVs. Nossos dados de proteômica comparativa entre a linhagem selvagem e mutante dsbA revelaram que importantes fatores de virulência que bactérias geralmente utilizam durante a patogênese, como hemolisinas, proteases e lipases, são secretados via OMVs e estão diferencialmente encontrados nas OMVs da linhagem mutante em relação à selvagem. Além disso, a deleção de dsbA impediu que C. violaceum estabeleça a infecção em camundongos, indicando o importante papel de OMVs durante a patogênese in vivo. Portanto, neste trabalho descrevemos mecanismos de vesiculação tanto espécie-específicos, como o mediado pela violaceína, quanto mecanismos mais gerais controlados por genes altamente conservados que potencialmente são empregados por outras bactérias Gram-negativas de relevância clínica. Sendo assim, nosso estudo fortalece a ideia de utilizar sistemas que controlam a biogênese de OMVs, como VacJ/YrbBCDEF e DsbA como importantes alvos antimicrobianos.

Outer membrane vesicles (OMVs) are spherical nanoparticles (20-300 nm) naturally released from the outer membrane of Gram-negative bacteria to the extracellular milieu. Recent studies indicated that OMVs are important to bacterial physiology, interbacterial interactions, and host-pathogen interactions, playing pivotal roles in pathogenesis, bacterial response to stresses, and human microbiota homeostasis. In this work, we studied biogenesis pathways, protein composition, cargo selection, and the in vivo role of OMVs of Chromobacterium violaceum, a free-living ubiquitous Gram-negative rod-shaped bacterium that can invade and replicate inside eukaryotic cells. Regarding OMV biogenesis in C. violaceum, we found three distinct mechanisms mediated by the lipid transport system VacJ/YrbBCDEF, the periplasmic protein DsbA, which assist folding and stability of secreted proteins, and by the hydrophobic antimicrobial molecule violacein. We showed that violacein controls C. violaceum vesiculation by inducing its own secretion through OMVs, promoting C. violaceum adaptation during competition against Gram-positive bacteria. The vesiculation rate of C. violaceum was controlled by quorum sensing via regulation of violacein synthesis and the VacJ/Yrb system. The VacJ/Yrb system showed a critical role in the homeostasis of vesiculation and maintenance of C. violaceum virulence. Null mutants lacking the vacJ or yrbE genes were unable to invade epithelial cells and had their virulence completely attenuated in a murine model, although the mutants did not show physiological or morphological problems, as revealed by phenotypic assays and electron microscopy. Thus, these data favor a model in which the increased uncontrolled vesiculation is harmful to the maintenance of virulence mechanisms that C. violaceum uses during the invasion of eukaryotic cells to establish its intracellular niche. We also found that DsbA protein is important to protein sorting and quality into OMVs. Our comparative proteomic analysis between wild-type strain and dsbA mutant revealed that important virulence factors that bacteria usually use during pathogenesis, such as hemolysins, proteases, and lipases, are differentially expressed in dsbA mutant OMVs compared to the wild-type. Besides, dsbA deletion impaired C. violaceum establishment in mice, suggesting an important role of OMVs during pathogenesis in vivo. Thus, we described in this work specific (violacein) and general mechanisms of vesiculation controlled by genes highly conserved that are potentially used by other Gram-negative bacteria with clinical importance. Therefore, our study reinforces the idea to use OMVs biogenesis control systems, such as the VacJ/YrbBCDEF and DsbA, as important antimicrobial targets.