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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2022.tde-03102022-091324
Documento
Autor
Nombre completo
Kelly Cristina Martins Barroso
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2022
Director
Tribunal
Silva Neto, José Freire da (Presidente)
Hernandes, Rodrigo Tavanelli
Sgro, Germán Gustavo
Silva, Luis Lamberti Pinto da
Título en portugués
Caracterização do sistema de secreção do tipo II de Chromobacterium violaceum
Palabras clave en portugués
Análise do exoproteoma
Chromobacterium violaceum
Enzimas hidrolíticas extracelulares
Genética e fisiologia bacteriana
Sistema de secreção do tipo II
Sistemas de secreção
Virulência bacteriana
Resumen en portugués
Bactérias usam sofisticadas nanomaquinarias para secreção de proteínas através do envelope celular. O sistema de secreção do tipo II (T2SS) transloca via periplasma proteínas que atuam como toxinas e enzimas hidrolíticas extracelulares. Neste trabalho, caracterizamos o T2SS de Chromobacterium violaceum, uma bactéria Gramnegativa que pode atuar como um patógeno oportunista em humanos. O T2SS de C. violaceum é codificado por 13 genes (operon gspCDEFGHIJKLMN e pilD). A atividade promotora do operon gsp do T2SS aumentou na presença de sais biliares e na transição da fase logarítmica para a fase estacionária. A aumentada expressão em alta densidade celular não foi dependente do sistema de quorum sensing CviIR. Foram obtidas quatro linhagens mutantes do T2SS, com deleção dos genes gspD (secretina), gspE (ATPase), pilD (prepilina peptidase) e gspC-N (deleção de todo o operon gsp). Curvas de crescimento, contagem de UFCs e ensaios de live/dead e microscopia eletrônica revelaram que as linhagens mutantes T2SS têm atraso de crescimento e drástica redução de viabilidade em culturas de fase estacionária. Os mutantes T2SS apresentaram comprometimento da membrana externa, como demonstrado por curvas de crescimento na presença do antibiótico polimixina B e ensaios de permeabilidade ao brometo de etídio. O mutante duplo ΔgspDΔcviI teve melhora de fitness, sugerindo que proteínas reguladas pelo sistema de quorum sensing CviIR acumulariam no periplasma e prejudicariam o fitness dos mutantes T2SS em alta densidade celular. Os ensaios de atividade hidrolítica em placa, realizados em meio M9 suplementado com substratos específicos, revelaram que todos os mutantes T2SS apresentaram atividade diminuída de protease, gelatinase, quitinase e hemolisina. Os halos de atividade proteolítica da linhagem selvagem diminuíram na presença do agente quelante de metais EDTA, indicando que C. violaceum secreta metaloproteases via T2SS. Análise quantitativa por espectrometria de massas comparando os exoproteomas da linhagem selvagem e do mutante ΔgspD permitiram a identificação várias enzimas hidrolíticas secretadas pelo T2SS de C. violaceum, incluindo proteases, colagenases, quitinases e lecitinase. Para caracterizar alguns substratos secretados pelo T2SS de C. violaceum, foram obtidas as linhagens mutantes ΔCV_2001 e ΔCV_3255 (colagenases), ΔCV_2571 e ΔCV_0057 (proteases), ΔCV_1440 e ΔCV_3931 (quitinases) e ΔCV_0362 (hemolisina/lecitinase). As curvas de crescimento em meio LB mostraram que essas linhagens mutantes não têm problemas de crescimento. Em relação a produção de biofilme, apenas o mutante ΔCV_2571 teve o biofilme reduzido. Nos ensaios de atividade hidrolítica em placa, apenas o ΔCV_0362 teve redução do halo de lecitinase/lipase. Os ensaios de virulência em camundongos com estes sete mutantes indicaram nenhuma ou fraca atenuação de virulência, sugerindo que as enzimas secretadas pelo T2SS podem ter papel redundante. Em conjunto, os resultados deste trabalho indicam que C. violaceum expressa um T2SS funcional que é necessário para a secreção de diversas enzimas hidrolíticas extracelulares.
Título en inglés
Characterization of the type II secretion system of Chromobacterium violaceum
Palabras clave en inglés
Bacterial virulence
Chromobacterium violaceum
Exoproteome analysis
Extracellular hydrolytic enzymes
Physiology and genetics of bacteria
Secretion systems
Type II secretion system
Resumen en inglés
Bacteria use sophisticated nanomachineries to secrete proteins across the cell envelope. The type II secretion system (T2SS) translocates, via the periplasm, proteins that act as toxins and extracellular hydrolytic enzymes. In this work, we characterized the T2SS from Chromobacterium violaceum, a Gram-negative bacterium that can act as an opportunistic pathogen in humans. The C. violaceum T2SS is encoded by 13 genes (operon gspCDEFGHIJKLMN and pilD). The promoter activity of the T2SS gsp operon increased in the presence of bile salts and in the transition from logarithmic to stationary phase. The increased expression at high cell density was not dependent on the CviIR quorum sensing system. Four T2SS mutant strains were obtained, with deletion of the genes gspD (secretin), gspE (ATPase), pilD (prepilin peptidase), and gspC-N (deletion of the entire gsp operon). Growth curves, CFU counting, and live/dead and electron microscopy assays revealed that the T2SS mutant strains had growth imparaired and drastic reduction in viability in stationary phase cultures. The T2SS mutants showed damage of the outer membrane, as demonstrated by growth curves in the presence of the antibiotic polymyxin B and ethidium bromide permeability assays. The double mutant ΔgspDcviI had improved fitness, suggesting that proteins regulated by the quorum sensing system CviIR would accumulate in the periplasm and impair the fitness of T2SS mutants at high cell density. The hydrolytic activity assays in plate, performed in M9 medium supplemented with specific substrates, revealed that all T2SS mutants showed decreased protease, gelatinase, chitinase, and hemolysin activity. The halos of proteolytic activity of the wild-type strain decreased in the presence of the metal chelating agent EDTA, indicating that C. violaceum secretes metalloproteases via T2SS. Quantitative mass spectrometry analysis comparing the exoproteomes of the wild-type and ΔgspD mutant allowed the identification of several hydrolytic enzymes secreted by T2SS from C. violaceum, including proteases, collagenases, chitinases, and lecithinase. To characterize some substrates secreted by T2SS from C. violaceum, we obtained the mutant strains ΔCV_2001 and ΔCV_3255 (collagenases), ΔCV_2571 and ΔCV_0057 (proteases), ΔCV_1440 and ΔCV_3931 (chitinases), and ΔCV_0362 (hemolysin/lecithinase). Growth curves in LB medium showed that these mutant strains do not have growth impairment. Regarding biofilm production, only the ΔCV_2571 mutant had reduced biofilm. In the hydrolytic activity assays in plate, only ΔCV_0362 had a reduction in the lecithinase/lipase halo. Virulence assays in mice with these seven mutants indicated no or weak attenuation of virulence, suggesting that enzymes secreted by T2SS may play a redundant role. Taken together, the results of this work indicate that C. violaceum expresses a functional T2SS that is necessary for the secretion of several extracellular hydrolytic enzymes.
 
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Fecha de Publicación
2022-10-06
 
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