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Disertación de Maestría
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2020.tde-02122020-111636
Documento
Autor
Nombre completo
Vinicius Marques de Lima
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2020
Director
Tribunal
Silva Neto, José Freire da (Presidente)
Silva, Aline Maria da
Souza, Alessandra Alves de
Título en portugués
Mecanismos de captação de heme em Chromobacterium violaceum
Palabras clave en portugués
Captação de ferro
Captação de heme
Chromobacterium violaceum
Fisiologia bacteriana
Genética de bactérias
Virulência bacteriana
Resumen en portugués
O ferro é um metal essencial em diversos processos celulares, como respiração e regulação gênica, atuando como cofator de diferentes proteínas bacterianas. Uma importante fonte de ferro no hospedeiro é encontrada no grupo heme de hemoproteínas como a hemoglobina. Desta forma, bactérias evoluíram mecanismos eficazes para aquisição de ferro, como a síntese de pequenas moléculas quelantes conhecidas como sideróforos e a expressão de transportadores especializados na captação de sideróforos e hemoproteínas. Neste trabalho, os mecanismos de captação de heme foram caracterizados em Chromobacterium violaceum, uma betaproteobactéria Gram-negativa oportunista que ocasionalmente causa severas infecções em humanos. Análises in silico no genoma de C. violaceum ATCC 12472 revelaram os genes CV_3895-96-97-RS19290-CV_3898-99, aqui nomeados chuPRSTUV, como candidatos a codificar uma proteína regulatória (ChuP), um receptor dependente de TonB de membrana externa (ChuR), uma enzima de degradação de heme (ChuS) e um transportador do tipo ABC de membrana interna (ChuTUV). Linhagens mutantes nulas com deleção dos genes chuP, chuR, chuS, chuTUV e chuPRSTUV foram obtidas; um mutante com deleção dos genes chuPRSTUV e dos genes de síntese de sideróforos cbaCEBA também foi gerado. Tanto a linhagem selvagem quanto as linhagens mutantes apresentaram alta tolerância à toxicidade do heme avaliada por viabilidade celular. Com exceção de chuS, todos os demais genes do operon chuPRSTUV se mostraram necessários para utilização de heme e hemoglobina em ensaios de estimulação. Além disso, as linhagens DchuP, DchuPRSTUV e DcbaCEBADchuPRSTUV apresentaram atraso de crescimento em situações de carência e/ou suficiência de ferro obtida com heme. Interessantemente, o gene chuP apresentou papel na atividade de sideróforos, demonstrado por ensaio de CAS com halo aumentados nos mutantes sem chuP. Ensaios de expressão demonstraram que o operon chuPRSTUV é controlado por um promotor a frente do gene chuP que responde à presença de ferro e heme, sendo mais expresso em situação de limitação destas moléculas. A proteína ChuP interagiu com heme in vitro e sua atividade regulatória parece ser pós-transcricional, pois ChuP não mostrou atividade de ligação ao DNA. Ensaios in vivo em camundongos revelaram que o sistema ChuPRSTUV tem papel na virulência de C. violaceum, sendo observada atenuação de virulência em mutantes do operon chu sobretudo na ausência de sideróforos. Portanto, os dados obtidos neste trabalho revelaram que C. violaceum utiliza de modo hierárquico os mecanismos de captação de ferro por sideróforos e por heme para estabelecer infecção bem sucedida no hospedeiro.
Título en inglés
Mechanisms of heme uptake in Chromobacterium violaceum
Palabras clave en inglés
Bacterial genetics
Bacterial physiology
Bacterial virulence
Chromobacterium violaceum
Heme uptake
Iron uptake
Resumen en inglés
Iron is an essential metal in several cell processes, including respiration and gene expression, acting as a cofactor of different bacterial proteins. An important iron source in the host is found into the heme group of hemoproteins like hemoglobin. Therefore, bacteria evolved efficient mechanism for iron acquisition, like the production of small chelating molecules known as siderophores and the expression of specialized transporters for the uptake of siderophores and hemoproteins. In this work, we characterized the mechanisms of heme uptake in Chromobacterium violaceum, an opportunistic Gram-negative beta-proteobacterium that occasionally causes severe infections in humans. In silico analyses in the C. violaceum ATCC 12472 genome revealed the genes CV_3895-96-97-RS19290-CV_3898-99, here named chuPRSTUV, as candidates for coding a regulatory protein (ChuP), an outer membrane TonB-dependet receptor (ChuR), a heme degradation enzyme (ChuS), and an inner membrane ABC-type transporter (ChuTUV). Null-mutant strains with deletion of chuP, chuR, chuS, chuTUV, and chuPRSTUV were obtained; a mutant strain with deletion of the chuPRSTUV and cbaCEBA genes, the latter for siderophore synthesis, was also generated. Both the wild-type and mutant strains showed high tolerance to heme toxicity assessed by cell viability. With the exception of chuS, all other genes in the chuPRSTUV operon were required for heme and hemoglobin utilization in stimulation assays. Besides, the DchuP, DchuPRSTUV, and DcbaCEBADchuPRSTUV strains displayed delayed growth under iron deficiency and/or heme sufficiency. Interestingly, the chuP gene demonstrated a role in siderophore activity, displayed by increased halos in CAS assay for the mutants without chuP. Expression assays demonstrated that the chuPRSTUV operon is controlled by a promoter in front of the chuP gene that responds to the presence of iron and heme, being more expressed in a situation where these molecules are limited. The ChuP protein interacted with heme in vitro and its regulatory activity appears to be post-transcriptional, as ChuP showed no DNA-binding activity. In vivo assays with mice revealed that the ChuPRSTUV system plays a role in the C. violaceum virulence, with attenuation of virulence observed in mutants of the chu operon mainly in the absence of siderophores. Therefore, the data obtained in this work revealed that C. violaceum uses hierarchically the mechanisms of iron uptake by siderophores and by heme to establish a successful infection in the host.
 
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Fecha de Publicación
2021-01-28
 
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