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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2012.tde-29092022-101321
Documento
Autor
Nome completo
Alexandre Palma Boer Martins
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2016
Orientador
Banca examinadora
Goldman, Maria Helena de Souza (Presidente)
Chabregas, Sabrina Moutinho
Souza, Silvana Aparecida Creste Dias de
Título em português
Caracterização do fator de transcrição ShSHN1 de cana-de-açúcar e sua relação com a biossíntese da parede celular em plantas transgênicas de arroz
Palavras-chave em português
Arroz
Cana-de-açúcar
Resumo em português
O melhoramento genético de culturas com elevada capacidade para produção de biomassa, como a cana-de-açúcar, apresenta grande importância no desenvolvimento de matérias primas que possam ser utilizadas como fonte renovável de energia. A biomassa vegetal possui grande potencial para a produção de etanol 2G, contudo a lignina, um componente estrutural da parede celular vegetal, dificulta o processo de sacarificação e obtenção deste biocombustível. Para superar esta limitação, muitos genes têm sido identificados e utilizados para alterar o conteúdo e/ou composição da lignina, bem como de outros constituintes da parede celular, através de engenharia genética. Dentre eles, alguns fatores de transcrição membros do clado SHINE (SHN) têm sido considerados alvos promissores recentes. A fim de se avaliar funcionalmente o FT ShSHN1 de cana-de-açúcar e sua possível relação com a biossíntese da parede celular, este gene foi isolado e superexpresso em arroz (Oryza sativa), uma planta monocotiledônea modelo. Para isso, um vetor de transformação genética foi construído utilizando o sistema Gateway de recombinação - contendo o promotor constitutivo Ubi-1 regulando a expressão de ShSHN1 - e calos embriogênicos foram transformados via Agrobacterium tumefaciens. O DNA extraído a partir das plantas regeneradas em meio contendo higromicina foi purificado para a confirmação dos eventos transgênicos por PCR. A expressão relativa do transgene e de possíveis genes alvo do FT ShSHN1 foi avaliada por qPCR e o número de cópias estimado por Taqman®. Linhagens transgênicas com cópia única foram cultivadas em casa de vegetação e submetidas a analises biométricas, bioquímicas e moleculares. Além disso, a localização subcelular de ShSHN1 foi analisada por expressão transiente em células de tabaco utilizando a detecção por GFP. Como resultados, a fluorescência da GFP foi observada exclusivamente no núcleo das células transformadas. Além disso, foram obtidas 12 linhagens transgênicas ShSHN1 em arroz, das quais três apresentam níveis de expressão elevados, sendo selecionadas para caracterização funcional (6A, 19A e 20A). As análises de expressão gênica de possíveis genes alvo indicaram alterações nos padrões de genes de lignina, celulose, hemicelulose, além de cera e cutina, nas linhagens ShSHN1. Complementarmente, as análises biométricas revelaram um aumento no crescimento vegetativo das plantas, com acréscimos significativos em parâmetros como número total de perfilhos, altura máxima da planta, comprimento e largura da folha bandeira, além de um incremento em até 50% no conteúdo de biomassa seca quando comparadas ao WT. As análises dos componentes da parede celular indicaram a redução na quantidade de lignina total em até 40% e um aumento na quantidade de pectinas em até 200%. A eficiência no processo de sacarificação também apresentou uma melhora significativa com valores até 50% superiores em relação ao grupo controle. A diminuição no conteúdo de lignina, o aumento da biomassa, e a maior eficiência no processo de sacarificação aqui obtidos, evidencia o grande potencial de estudo e aplicação do FT ShSHN1 na pesquisa e desenvolvimento de biocombustíveis como o etanol 2G, abrindo novos horizontes para a engenharia genética de culturas energéticas como a cana-de-açúcar.
Título em inglês
Characterization of sugarcane ShSHN1 transcription factor sugar and its relationship with cell wall biosynthesis in transgenic rice plants
Palavras-chave em inglês
Rice
Sugarcane
Resumo em inglês
The genetic breeding of crops with high capacity for biomass production such as sugarcane has great importance in the development of feedstocks that can be used as a renewable energy source. The biomass has great potential for the production of ethanol 2G, however lignin, a structural component of plant cell wall, impairs the process of saccharification and obtaining of this biofuel. To overpass this limitation, many genes have been identified and used to alter the content and/or composition of lignin and other cell wall constituents by genetic engineering. Among them, some members of transcription factors belonging to SHINE clade (SHN) have been considered recently as promising targets. In order to functionally evaluate the sugarcane FT ShSHN1 and its relationship to biosynthesis of the cell wall, this gene was isolated and overexpressed in rice (Oryza sativa), a monocot plant model. For this, a transformation vector was built using the Gateway recombination system - containing the constitutive promoter Ubi-1 regulating the ShSHN1 expression - and embryogenic calli were transformed via Agrobacterium tumefaciens. The DNA extracted from the regenerated plants in selective medium containing hygromycin was purified for confirmation of transgenic events by PCR. The relative expression of the transgene and possible targets genes of FT ShSHN1 was evaluated by qPCR and the copy number were estimated by Taqman®. Transgenic lines with a single copy were grown in a greenhouse and subjected to biometric, biochemical and molecular analysis. Furthermore, ShSHN1 subcellular location was analyzed by transient expression in tobacco cells using GFP detection. The results showed that fluorescence of GFP was observed only in the nucleus of transformed cells. In addition, 12 ShSHN1 transgenic rice lines were obtained and three of them, exhibiting the highest transgene expression levels, were selected for functional characterization (6A, 19A and 20A). The gene expression analysis of ShSHN1 and potential target genes showed changes in patterns of lignin, cellulose, hemicellulose, and wax and cutin genes in ShSHN1 lines. In addition, biometric analysis revealed an increase in vegetative growth, with significant increases in parameters such as number of tillers, maximum plant height, length and width of the flag leaf, and an increase up to 50% in the content of dry biomass when compared to WT. Cell wall components analysis indicated a reduction in total amount of lignin up to 40% and an increase in the amount of pectins up to 200%. Furthermore, the efficiency of saccharification process also showed a significant improvement with values up to 50% higher than control group. The reduction in lignin content, increased biomass, and more efficient saccharification process presented here, highlights the great potential of this study and the application of FT ShSHN1 in research and development of biofuels such as 2G ethanol, opening new horizons for genetically engineered of energy crops such as sugarcane.
 
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Data de Publicação
2022-10-31
 
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