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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.17.2012.tde-22042013-164226
Documento
Autor
Nome completo
Luís Antonio Alves de Toledo Filho
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2012
Orientador
Banca examinadora
Goldman, Maria Helena de Souza (Presidente)
Carrer, Helaine
Peres, Lazaro Eustaquio Pereira
Título em português
Expressão do Gene iaaM de Agrobacterium tumefaciens no Estigma de Nicotiana tabacum: Efeitos de Níveis Aumentados de Auxina no Desenvolvimento do Pistilo
Palavras-chave em português
Auxina
Desenvolvimento
Pistilo
Resumo em português
A reprodução das plantas é um tópico de grande interesse para a ciência básica e para a agricultura. O pistilo, a estrutura reprodutiva feminina das angiospermas, é um órgão que desempenha papéis importantes no sucesso reprodutivo. É responsável por receber os grãos de pólen, fornecer as condições para a hidratação destes e a emissão de tubos polínicos que crescem em direção ao ovário. Adicionalmente, o pistilo produz frutos e sementes após a fecundação dos óvulos, contidos no interior do ovário. Há muito tempo se estuda o fito-hormônio auxina e muito se sabe sobre sua ação fisiológica e molecular. Contudo, embora avanços recentes sugiram uma grande influência deste hormônio no controle do desenvolvimento do pistilo, são escassos os dados na literatura sobre a influência de níveis aumentados de auxina no desenvolvimento das partes superiores do pistilo: estigma e estilete. Para preencher esta lacuna, este projeto teve como objetivos: I) produzir plantas transgênicas de Nicotiana tabacum com níveis aumentados de auxina no pistilo, através da expressão da enzima de biossíntese de auxina triptofano-monoxigenase (iaaM), de Agrobacterium tumefaciens, sob controle do promotor de N. tabacum STIG1, o qual confere expressão específica no estigma; II) analisar o fenótipo do pistilo das plantas transgênicas obtidas, comparando-as com plantas selvagens, principalmente quanto à morfologia do pistilo e aos parâmetros reprodutivos; e III) caracterizar, através de RT-PCR quantitativa, os padrões de expressão de diferentes genes putativos de resposta a auxina nos pistilos de plantas transgênicas e controle. No total, 19 plantas transgênicas estáveis foram obtidas, das quais 13 apresentaram alterações morfológicas evidentes no pistilo. Os estiletes das plantas transgênicas STIG1prom::iaaM apresentaram-se mais compridos nos estádios iniciais do desenvolvimento floral, porém mais curtos e espessos nos estádios finais. Juntos, tais fatos sugerem um modo diferencial de percepção de níveis elevados de auxina pelo pistilo ao longo de seu desenvolvimento. Na antese, observou-se nestas plantas uma diminuição da área da superfície estigmática, com concomitante redução na secreção de exudato. Adicionalmente, plantas STIG1prom::iaaM apresentaram dificuldades no processo de auto-polinização e frutos, produzidos a partir de polinização manual controlada de pistilos transgênicos, apresentaram um tamanho final reduzido, evidenciando efeitos deletérios de níveis aumentados de auxina no desenvolvimento do pistilo e/ou no processo de polinização. Medições de auxina via LQ-MS confirmaram um considerável incremento dos níveis endógenos deste hormônio nos pistilos de uma planta transgênica (STIG1prom::iaaM 4), para os três estádios do desenvolvimento analisados. Análises de expressão gênica para 9 genes putativos de resposta a auxina, por qRT-PCR, para pistilos de três plantas transgênicas de três estádios distintos do desenvolvimento floral, revelaram significativas alterações no transcriptoma do pistilo das plantas transgênicas, sugerindo uma contribuição molecular para alguns dos genes analisados no estabelecimento dos fenótipos observados. Além de fornecerem informações relevantes sobre o papel da auxina no desenvolvimento do pistilo, as plantas transgênicas STIG1prom::iaaM, obtidas neste projeto, constituem excelentes ferramentas para investigações futuras sobre os efeitos da auxina na regulação da expressão gênica em nível transcricional e pós-transcricional de genes expressos no pistilo.
Título em inglês
Expression of the iaaM Gene from Agrobacterium tumefaciens in the Nicotiana tabacum Stigma: Effects of Increased Levels of Auxin on the Pistil Development
Palavras-chave em inglês
Auxina
Development
Pistilo
Resumo em inglês
Plant reproduction is a topic of great interest for both basic science and agriculture. The pistil, the angiosperms female reproductive structure, is an organ that plays important roles on the successful reproduction. It is responsible for receiving pollen grains, providing conditions for their hydration and the emission of pollen tubes that grow towards the ovary. In addition, the pistil produces fruits and seeds after the fecundation of the ovules, contained in the ovary. Since a very long time the phytohormone auxin is studied and much is known about its physiological and molecular modes of action. Nevertheless, even though recent advances suggest a great influence of this hormone on the control of the pistil development, there are scarce data in the literature about the influence of elevated levels of auxin on the development of the upper parts of the pistil: the stigma and style. To fill this gap, this project aimed: I) to produce transgenic Nicotiana tabacum plants with elevated auxin levels within the pistil through the expression of the auxin biosynthesis enzyme tryptophan-monoxygenase (iaaM), from Agrobacterium tumefaciens, under the control of the N tabacum STIG1 promoter, which confers stigma-specific expression; II) to analyze the pistil phenotype of the transgenic plants obtained, comparing with wild-type plants, mainly concerning the pistil morphology and reproductive parameters; and III) to characterize through quantitative RT-PCR the expression patterns of different putative auxin-responsive genes in the pistils of transgenic and control plants. A total of 19 stable transgenic plants were obtained, from which 13 presented evident morphological alterations on the pistil. The styles of the STIG1prom::iaaM transgenic plants were longer at the early floral developmental stages, but shorter and thicker at the final stages. Together, these facts suggest a differential mode of perception of elevated auxin levels by the pistil along its development. At anthesis, it was observed a decrease on the stigmatic surface area, with concomitant reduction in the exudate secretion in these plants. Additionally, STIG1prom::iaaM plants presented difficulties in the self-pollination process, and fruits produced by hand-controlled-pollination of transgenic pistils had a reduced final size, making evident the deleterious effects of elevated auxin levels on pistil development and/or on the pollination process. Auxin measurements via LC-MS confirmed a considerable increment in the endogenous levels of this hormone in the pistils of one transgenic plant (STIG1prom::iaaM 4), for the three developmental stages analyzed. Gene expression analyses for 9 putative auxin-responsive genes through qRT-PCR, in pistils from three transgenic plants of three distinct floral developmental stages, revealed significant alterations on the pistil transcriptome of the transgenic plants, suggesting a molecular contribution for some of the analyzed genes on the establishment of the observed phenotypes. Besides providing relevant information concerning the role of auxin in pistil development, the transgenic plants STIG1prom::iaaM, obtained in this project, consist excellent tools for future investigations about the effects of auxin in the regulation of gene expression at the transcriptional and post-transcriptional levels of pistil expressed genes.
 
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Data de Publicação
2013-05-24
 
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