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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2020.tde-13022020-105842
Documento
Autor
Nome completo
Johnathan de Andrade Vieira
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2019
Orientador
Banca examinadora
Hojo, Elza Tiemi Sakamoto (Presidente)
Ferriolli, Eduardo
Antunes, Lusania Maria Greggi
Ayres, Flávio Monteiro
Título em português
Estresse oxidativo e alterações nos perfis de expressão gênica em idosos com comprometimento cognitivo leve
Palavras-chave em português
Alterações mitocondriais
Ciclo celular
Comprometimento cognitivo leve
Dano e reparo do DNA
Envelhecimento
Estresse oxidativo
Resumo em português
O envelhecimento é marcado pelo declínio funcional e cognitivo com maior suscetibilidade a doenças relacionadas à idade, sendo a idade um dos principais fatores de risco para doenças neurodegenerativas. O decaimento da cognição normal associado à idade, sem o declínio funcional, é caracterizado como Comprometimento Cognitivo Leve (CCL). No funcionamento normal do metabolismo, há o equilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a defesa antioxidante, mas quando há o desequilíbrio entre a geração de ROS e a ineficácia dos mecanismos celulares de defesa antioxidante ocorre o estresse oxidativo, culminando em instabilidade genômica. A hipótese do presente trabalho é que os pacientes com CCL e os indivíduos sadios (N-CCL) apresentam níveis diferentes de dano oxidativo no DNA, alterações em genes associados à progressão do ciclo celular e reparo do DNA, além de alterações ao nível de mitocôndrias. Sendo assim, o presente estudo consistiu em analisar as alterações celulares e moleculares em células mononucleares do sangue periférico de pacientes com CCL comparados ao grupo N-CCL. A análise dos níveis de danos no DNA (ensaio cometa com OGG1) em células mononucleares, realizada para os grupos N-CCL (n = 17) e CCL (n = 9), indicaram um nível elevado de dano oxidativo (8-oxodG), estatisticamente significativo (p<0,01) em CCL comparado ao N-CCL, mas não houve diferença significativa entre os grupos estudados para os resultados quanto ao dano basal no DNA (ensaio cometa convencional). Para alguns indivíduos de ambos os grupos, N-CCL (n = 7) e CCL (n = 6), foi analisada a expressão de genes com funções associadas ao estresse oxidativo, progressão do ciclo celular e dano ao DNA. Os níveis de expressão transcricional dos genes ATM, ATR e MTH1 não foram alterados; apenas o gene CDKN1A apresentou expressão significativamente aumentada em CCL em relação ao grupo N-CCL. A análise de expressão proteica para SOD1 e TP53, realizada por Western Blot, mostrou que somente a TP53 apresentou um aumento significativo (p<0,05) de aproximadamente 1,9 vezes nos indivíduos CCL, comparativamente ao grupo N-CCL. Por meio de citometria de fluxo utilizando corantes fluorescentes, foramavaliadas alterações nos níveis de ROS intracelular e em parâmetros mitocondriais (massa, potencial de membrana, níveis de ROS), sendo observadas alterações significativas apenas na massa mitocondrial (p<0,05) em pacientes com CCL comparados aos N-CCL, não havendo diferenças entre os grupos quanto aos demais parâmetros. Em conjunto, os resultados indicaram níveis aumentados de dano oxidativo ao DNA, alteração na massa mitocondrial e maior expressão do gene CDKN1A nos pacientes com CCL. Ainda que com um número de amostras limitado, os resultados mostraram que lesões oxidativas, alterações na expressão de TP53 e na massa mitocondrial dos pacientes CCL possam representar características relevantes nos estágios iniciais da demência, mas ainda, sem manifestações fenotípicas de maior gravidade.
Título em inglês
Oxidative stress and alterations in gene expression profiles in elderly with mild cognitive impairment
Palavras-chave em inglês
Aging
Cell cycle
DNA damage and repair
Mild cognitive impairment
Mitochondrial alterations
Oxidative stress
Resumo em inglês
Aging process is marked by functional and cognitive decline with increased susceptibility to age-related diseases, and age itself seems to be a main risk factor for neurodegenerative diseases. The age-related decay of normal cognition is characterized as Mild Cognitive Impairment (MCI). In the normal functioning of the metabolism, there is a balance between the production of reactive oxygen species (ROS) and antioxidant defense, but when there is an imbalance between the increase of ROS and the inefficacy of the cellular mechanisms of antioxidant defense, oxidative stress occurs, culminating in genomic instability. The hypothesis of the present work is that patients with MCI and healthy individuals (N-MCI) present different levels of DNA oxidative damage, changes in the expression of genes associated with cell cycle progression and DNA repair, as well as changes in mitochondria. The present study consisted of analyzing cellular and molecular alterations in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of MCI patients compared to the N-MCI group. Analysis of DNA damage levels (hOGG1 assay) was performed in PBMC of N-MCI (n = 17) and MCI (n = 9) groups of patients; the results indicated a higher level of oxidative damage (8-oxo-dG) (p <0.01) in MCI compared to N-MCI, but there was no significant difference between the two groups regarding DNA damage levels (conventional comet assay). For few individuals from both groups, N-MCI (n = 7) and MCI (n = 6), transcript and protein expression were evaluated for genes associated with oxidative stress, cell cycle progression and DNA damage. The levels of transcript expression of ATM, ATR and MTH1 genes were not changed, but only the CDKN1A gene showed a significant increase in the expression level in MCI compared to the N-MCI group. The expression of SOD1 and TP53 proteins, analyzed by Western blot, showed that only TP53 presented a significant increase (p <0.05) of approximately 1.9 times more in MCI, compared to N-MCI patients. By using flow cytometry with fluorescent dyes, we analyzed intracellular ROS and mitochondrial parameters (mass, membrane potential, ROS levels) in PBMCs; significant changes were observed only for mitochondrial mass(p <0.05) when MCI patients were compared to the N-MCI group. Therefore, the results indicated increased levels of oxidative DNA damage, altered mitochondrial mass and increased CDKN1A gene expression in MCI patients. Although with a limited number of samples, the present results showed that oxidative damage, alterations in TP53 expression and mitochondrial mass of MCI patients may represent relevant characteristics in the early stages of dementia, but still without perceptible phenotypic manifestations.
 
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Johnathan.pdf (1.75 Mbytes)
Data de Publicação
2020-05-05
 
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