A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa progressiva e complexa, sendo que a terapia para os pacientes com essa doença se baseia na utilização de inibidores da enzima acetilcolinesterase (AChEIs), uma das principais classes de medicamentos. No entanto, existe ainda um imenso desafio quanto ao desenvolvimento de compostos eficazes e dotados de baixa citotoxicidade e de efeitos colaterais para os pacientes. Nesse sentido, a ativação via PI3K/AKT tem sido considerada uma estratégia promissora para promover efeitos neuroprotetores. Essa via molecular é uma importante cascata de sinalização capaz de causar um impacto funcional significativo nos neurônios. Segundo a literatura, a proteína PTEN apresenta um papel importante na regulação negativa da via PI3K/AKT, provavelmente contribuindo como um evento patológico na DA, sendo que PTEN é regulado positivamente por ROCK. Há evidências de que os efeitos da inibição da PTEN e ROCK causaram um aumento na diferenciação e sobrevivência neuronal em modelos experimentais estudados, indicando que essas proteínas podem constituir possíveis alvos de intervenção molecular a serem investigados no tratamento de doenças neurodegenerativas. Assim, a hipótese do presente trabalho é que um novo composto AChEI, TA8Amino, poderia atuar na inibição da AChE e da proteína ROCK2, resultando na inativação de PTEN e, consequentemente, na ativação da sinalização PI3K/AKT, promovendo a neurodiferenciação e neuritogênese em células da linhagem SH-SY5Y, utilizada como modelo experimental. Além disso, uma outra hipótese testada foi que a modulação direta de PTEN ou de ROCK poderia promover neuroproteção e a neurogênese, por meio da ativação da via de sinalização AKT. Portanto, o objetivo consistiu em caracterizar o potencial terapêutico do novo composto TA8Amino na indução da neurodiferenciação em células SH-SY5Y. Além disso, um outro objetivo foi elucidar os mecanismos moleculares envolvidos na indução de neurogênese e neuritogênese pela ativação da sinalização PI3K/AKT, utilizando estratégias de inibição de PTEN (knockdown por siRNA) e dos inibidores farmacológicos Y-27632 (inibidor de ROCK) e LY294002 (inibidor de PI3K/AKT) em modelos 2D e 3D de células neurais. Inicialmente, foram avaliados os efeitos do tratamento com AChEIs (TA8Amino, donepezila e tacrina) nas células SH-SY5Y indiferenciadas e neurodiferenciadas. TA8Amino foi capaz de inibir a AChE em concentrações não citotóxicas após 24 h, sendo que após 7 dias de diferenciação neuronal, TA8Amino e donepezila aumentaram as porcentagens de células neurodiferenciadas, bem como o comprimento dos neuritos; a diferenciação neuronal foi confirmada pela expressão da proteína β-III-tubulina e MAP2. Foi demonstrado que o composto TA8Amino induziu a ativação da sinalização PTEN/AKT. Por meio de um estudo in silico, foi estimado que TA8Amino pode se ligar de forma estável ao sítio ativo da proteína ROCK2. Experimentos in vitro em células SH-SY5Y demonstraram que o tratamento com TA8Amino reduziu significativamente a expressão da proteína ROCK2, em contraste com donepezila e tacrina. Portanto, esses resultados fornecem informações importantes sobre o mecanismo subjacente à ação de TA8Amino, com relação às atividades de múltiplos alvos. Uma vez demonstrado no presente estudo que a sinalização ROCK/PTEN/AKT se mostra relevante, implicada nos mecanismos de neurogênese, na sequência, foram avaliados os efeitos da inibição de ROCK pelo composto Y-27632 nas células SH-SY5Y; os resultados indicaram que ROCK promoveu o crescimento de neuritos e a diferenciação neuronal no modelo de neuroblastoma humano (SH-SY5Y). Adicionalmente, as células SH-SY5Y foram submetidas à inibição de PTEN por siRNA, seguindo vários ensaios para estudar a indução da neurogênese e da neuritogênese em diferentes tempos de análise. Foi também avaliada a expressão das principais proteínas chaves da via PI3K/AKT. A inibição de PTEN aumentou o comprimento dos neuritos e reduziu o tamanho citoplasmático, indicando a indução da diferenciação neuronal nas células SH-SY5Y, na ausência de indução de alterações nas taxas de proliferação e na cinética do ciclo celular. As análises de expressão proteica dos principais componentes da via AKT/GSK3-β/Tau mostraram que a inibição da PTEN foi capaz de modular seus níveis de expressão, levando a uma redução na fosforilação da Tau. Foi também demonstrado que o inibidor de PI3K (LY492002) previne a diferenciação neuronal induzida pela inibição de PTEN. Na próxima etapa, foi testada se a inibição de PTEN resultaria nos mesmos efeitos em culturas 2D e 3D de neurônios diferenciados de células progenitoras neurais humanas, derivadas de iPSCs (induced-pluripotent stem cells), oriundas de individuo não afetado. A caracterização da diferenciação neural das células NPCs 2D e 3D indicou a viabilidade de obtenção de neurônios maduros e neuritos alongados e densos. Aplicou-se também um ensaio de neuroproteção visando avaliar os efeitos da inibição de PTEN frente aos danos neurotóxicos induzidos pelo ácido ocadáico; a inibição de PTEN promoveu a recuperação da viabilidade neuronal, bem como o crescimento de neuritos após a indução de danos em ambos os modelos 2D e 3D de neurônios diferenciados de NPCs. Em conjunto, de forma geral, os dados do presente trabalho são interessantes e fornecem informações importantes sobre o mecanismo de ação do composto TA8Amino relacionada à sua atuação simultânea em dois diferentes alvos (ROCK e PTEN); a pesquisa sobre a inibição destes mostrou dados interessantes sobre o impacto da mesma, fornecendo suporte ao potencial de ambos como alvos moleculares terapêuticos por meio da via PI3K/AKT, com consequente aumento da neurogênese e da neuritogênese, além de efeitos neuroprotetores contra danos neurotóxicos induzidos. Tais informações abrem novas perspectivas de investigação com relação a novas modalidades de tratamentos mais eficazes para pacientes com doenças neurodegenerativas, baseadas na indução de neurogênese e neuritogênese, por meio de estratégias em nível molecular.

Alzheimer's disease (AD) is a progressive and complex neurodegenerative disease, and therapy for patients with this disease is based on the use of acetylcholinesterase enzyme inhibitors (AChEIs), a major class of drugs. However, there is still a huge challenge in developing effective compounds with low cytotoxicity and minimum side effects for patients. In this sense, activation of PI3K/AKT pathway has been considered a promising strategy to promote neuroprotective effects. This molecular pathway is an important signaling cascade capable of causing a significant functional impact on neurons. According to the literature, the PTEN protein plays an important role in the negative regulation of the PI3K/AKT pathway, probably contributing as a pathological event in AD, whereas PTEN is positively regulated by ROCK. There is evidence that the effects of PTEN and ROCK inhibition caused an increase in neuronal differentiation and survival in experimental models studied, indicating that these proteins may constitute possible molecular intervention targets to be investigated in the treatment of neurodegenerative diseases. Thus, the hypothesis of the present work is that a new AChEI compound, TA8Amino, could act in the inhibition of AChE and ROCK2 protein, resulting in the inactivation of PTEN and, consequently, in the activation of PI3K/AKT signaling, promoting neurodifferentiation and neuritogenesis in SH-SY5Y cell line, which was used as an experimental model. In addition, another hypothesis tested was that direct modulation of PTEN or ROCK could promote neuroprotection and neurogenesis through the activation of the AKT signaling pathway. Therefore, the objective was to characterize the therapeutic potential of the novel compound TA8Amino in inducing neurodifferentiation in SH-SY5Y cells. In addition, another aim was to elucidate the molecular mechanisms involved in the induction of neurogenesis and neuritogenesis by activation of PI3K/AKT signaling, using strategies of PTEN inhibition (knockdown by siRNA) and the pharmacological inhibitors Y-27632 (ROCK inhibitor) and LY294002 (PI3K/AKT inhibitor), tested in 2D and 3D neural cell models. Initially, the effects of AChEIs (TA8Amino, donepezil and tacrine) were evaluated in undifferentiated and neurodifferentiated SH-SY5Y cells. TA8Amino was able to inhibit AChE at non-cytotoxic concentrations after 24 h, and after 7 days of neuronal differentiation, TA8Amino and donepezil increased the percentages of neurodifferentiated cells as well as the length of neurites; neuronal differentiation was confirmed by β-III-tubulin and MAP2 protein expression. TA8Amino compound was found to induce activation of PTEN/AKT signaling. By an in-silico study, it was estimated that TA8Amino can bind stably to the active site of ROCK2 protein. In vitro experiments in SH-SY5Y cells demonstrated that treatment with TA8Amino significantly reduced ROCK2 protein expression, in contrast to donepezil and tacrine. Therefore, these results provide important information about the mechanism underlying the action of TA8Amino with respect to multiple target activities. Since the relevance of ROCK/PTEN/AKT signaling was demonstrated in the present work, and this pathway was found implicated in the mechanisms of neurogenesis, in the next step, we evaluated the effects of ROCK inhibition by the compound Y-27632; the results indicated that ROCK promoted neurite growth and neuronal differentiation in the human neuroblastoma model (SH-SY5Y). Additionally, SH-SY5Y cells were subjected to PTEN inhibition by siRNA, following various assays to study the induction of neurogenesis and neuritogenesis at different time-points. The expression of key proteins acting in the PI3K/AKT pathway was also evaluated. PTEN inhibition increased neurite length and reduced cytoplasmic size, indicating an induction of neuronal differentiation in SH-SY5Y cells, in the absence of changes in proliferation rates and cell cycle kinetics. Protein expression analyses for the main components of the AKT/GSK3-β/Tau pathway showed that PTEN inhibition was able to modulate their expression levels, leading to a reduction in Tau phosphorylation. PI3K inhibitor (LY492002) was also found to prevent neuronal differentiation induced by PTEN inhibition. Next, we tested whether PTEN inhibition would cause similar effects in 2D and 3D cultures of differentiated neurons from human NPCs (neural progenitor cells) derived from iPSCs (induced-pluripotent stem cells) donated by an unaffected individual. Characterization of neural differentiation of 2D and 3D NPCs indicated the feasibility of obtaining mature neurons and elongated, dense neurites. We also applied a neuroprotection assay aiming to evaluate the effects of PTEN inhibition against neurotoxic damage induced by okadaic acid; PTEN inhibition promoted recovery of neuronal viability as well as neurite growth after damage induction in both 2D and 3D models of differentiated neurons from NPCs. Taken together, overall, the data of the present work provide important information about the mechanism of the TA8Amino compound related to its simultaneous action on two different targets (ROCK and PTEN); the experiments on the inhibition of these targets showed interesting data, providing support for the potential of both, ROCK and PTEN, as therapeutic molecular targets through the PI3K/AKT pathway, with consequent enhancement of neurogenesis and neuritogenesis, as well as neuroprotective effects against neurotoxic-induced damage. Such information opens new research perspectives regarding novel and more effective treatment modalities for patients with neurodegenerative diseases, based on the induction of neurogenesis and neuritogenesis through strategies at the molecular level.