DNA mismatch repair (MMR) is a highly conserved pathway that maintains genomic integrity by repairing base-base mismatches and insertion-deletion loops generated during DNA replication. MMR deficiency is detected in a substantial fraction of tumors, especially endometrial cancer (EC), and is used as an indicator of cancer predisposition and a marker of resistance to certain chemotherapies, such as 6-thioguanine (6-TG). Germline and somatic inactivation of MLH1, MSH2, MSH6, and PMS2 genes, which encode the main components of the MMR pathway, is the leading cause of MMR deficiency. However, some MMR-deficient tumors do not harbor any alteration in MMR genes, suggesting that other genes could also drive the MMR-deficient (MMR-D) phenotype in cancer. To investigate the genetic etiologies of MMR deficiency, we established a Brazilian cohort of 242 EC cases and assessed the MMR status on tumors by immunohistochemistry, microsatellite instability, and MLH1-methylation. MMR deficiency was detected in 38.4% of tumors, and germline mutation in the main MMR genes was investigated in 37 MMR-D cases. We found germline pathogenic variants in 10/37 (27%) patients. Next, we explored the etiology of the 27 unexplained MMR-D tumors by germline and somatic next-generation sequencing of 63 genes related to cancer-predisposition and DNA repair. Germline variants in ATM, ATR, CHEK2, FAN1 and MUTYH genes were found in 26% of cases and were associated with a pronounced family history of cancer. Tumor sequencing revealed inactivating mutations in MMR genes, mainly in MSH6, as the leading cause of MMR deficiency in EC. Mutations in the exonuclease domain of POLE were found to be a frequent driver of MMR deficiency, probably by increasing mutation rates, resulting in the inactivation of MMR genes. Previous studies have identified WDHD1, an essential component of the eukaryotic replisome, as an MSH2 partner. Therefore, we constructed a Wdhd1-mutant cell line by CRISPR/Cas9 and interrogated the impact of the disrupted WDHD1-MSH2 interaction on the repair of replication errors and sensitivity to 6-TG. Disruption of WDHD1- MSH2 interaction did not increase the number of spontaneous mutations and did not lead to an MSI phenotype. On the other hand, Wdhd1-mutant cells acquired mild resistance to 6-TG. In conclusion, we have confirmed the inactivation of MMR genes as the main cause of MMR deficiency in EC. Additionally, germline mutations in other DNA repair genes are found in individuals with MMR-D tumors and may explain the high cancer incidence in their relatives. Finally, WDHD1 is not an alternative driver of MMR deficiency but might participate in the MMR-mediated response to 6-TG.

O reparo de pareamento incorreto de bases (MMR) é um mecanismo de reparo de DNA altamente conservado que mantém a integridade genômica através do reparo de bases malpareadas e de alças geradoras de inserções e deleções que ocorrem durante a replicação de DNA. Uma parcela considerável de tumores, sobretudo câncer de endométrio (CE), apresentam deficiência na via MMR (MMR-D), que é utilizada como um indicador de predisposição genética à câncer e como preditor de resistência à certos quimioterápicos, tais como 6- tioguanina (6-TG). A inativação germinativa ou somática dos genes MLH1, MSH2, MSH6, ou PMS2, que são os principais genes da via MMR, é a causa mais frequente da MMR-D. Contudo, alguns tumores com deficiência nessa via não apresentam nenhuma alteração nesses genes, o que sugere o envolvimento de outros genes na deficiência do sistema MMR em câncer. Com o objetivo de investigar as causas genéticas dessa deficiência, uma coorte brasileira composta por 242 casos de CE foi caracterizada por meio de imuno-histoquímica, instabilidade de microssatélites e metilação do gene MLH1. 38,4% dos tumores apresentaram deficiência na via MMR. A análise de variantes germinativa foi realizada em 37 destes casos. Foram encontradas variantes germinativas patogênicas em 10/37 (27%) pacientes. A etiologia dos 27 tumores MMR-D, sem uma causa determinada pela abordagem anterior, foi investigada por meio de sequenciamento de nova geração para análise de variantes germinativas e somáticas em 63 genes relacionados à predisposição à câncer e a vias de reparo de DNA. Variantes germinativas nos genes ATM, ATR, CHEK2, FAN1 e MUTYH foram encontradas em 26% dos casos, muitos destes associados à uma história familiar de câncer. Por meio do sequenciamento de DNA tumoral, foi possível confirmar a inativação de genes da via MMR, principalmente do gene MSH6, como a principal causa do fenótipo de MMR-D em CE. Ainda, os dados de sequenciamento dos tumores mostraram que mutações no domínio com atividade de exonuclease codificado pelo gene POLE são uma causa frequente desse fenótipo, provavelmente advindo do aumento do número de mutações com consequente inativação de genes da via MMR. Estudos anteriores identificaram a proteína WDHD1, que é um componente essencial do replissoma em eucariotos, como um parceiro de interação da proteína MSH2. Deste modo, geramos um modelo celular contendo mutações no gene Wdhd1 por CRISPR/Cas9 para avaliar o impacto da ruptura na interação entre WDHD1 e MSH2 no reparo de erros de replicação e na sensibilidade à 6-TG. A ausência de interação entre WDHD1 e MSH2 não gerou um aumento no número de mutações espontâneas e não desencadeou instabilidade de microssatélites no nosso modelo celular. Contudo, as células mutantes apresentaram resistência moderada à 6-TG. Este trabalho confirmou a inativação de genes MMR como a principal causa da deficiência da via MMR em CE. Mutações germinativas em genes de outras vias de reparo de DNA podem ser encontradas em indivíduos com tumores MMR-D, e podem explicar a alta incidência de câncer nas famílias desses pacientes. Por fim, o gene WDHD1 não é uma causa alternativa para o fenótipo de deficiência da via MMR, mas pode estar envolvido na resposta celular à 6-TG mediada por essa via.