A doença de Alzheimer (DA) é uma enfermidade neurodegenerativa causada por danos progressivos que comprometem as funções cognitivas, comportamento e memória. A DA se desenvolve devido a diversas alterações culminando na morte de neurônios; entre essas alterações, destacam-se o acúmulo de peptídeos betaamilóide, hiperfosforilação da proteína tau, estresse oxidativo e redução nos níveis do neutrotransmissor acetilcolina (ACh). Os tratamentos atualmente empregados para a DA são os inibidores de acetilcolinesterase (AChEIs), enzima responsável pela degradação da ACh, porém, estes apresentam eficácia limitada e efeitos colaterais para alguns pacientes sob uso prolongado. Nesse contexto, novos compostos híbridos da classe dos AChEIs foram sintetizados a partir de donepezila e tacrina, os quais são fármacos utilizados no tratamento da DA; tais compostos híbridos, TAHB3 e TA8Amino, têm sido estudados no presente laboratório, sob a hipótese de que possam apresentar capacidade neuroprotetora frente a danos oxidativos, além de induzir a neurodiferenciação. O objetivo do trabalho foi analisar os efeitos neuroprotetores de TAHB3 e TA8Amino em células PC12 diferenciadas em neurônios, frente a danos oxidativos induzidos pelo peróxido de hidrogênio (H2O2), além de analisar a capacidade destes em induzir a neurodiferenciação das células PC12. Para avaliar a capacidade indutora de neurodiferenciação, as células foram tratadas durante 7 dias com os compostos AChEIs em concentração próxima ao IC50, 5 µM para os compostos híbridos e 10 µM para donepezila e tacrina. A neurodiferenciação foi avaliada por meio de análises morfológicas e quantitativas da porcentagem de diferenciação neuronal (comprovada pela expressão de marcadores neuronais por imunofluorescência e Western Blot), bem como análise do comprimento de neuritos. Para analisar o potencial neuroprotetor dos compostos, as células PC12 foram diferenciadas em neurônios, utilizando Neuronal Growth Factor - NGF durante 7 dias; após esse período, as células foram pré-tratadas com os AChEIs e depois submetidas à ação do H2O2. A porcentagem de viabilidade celular (ensaio do XTT), alteração da cinética do ciclo celular e indução de morte por apoptose e necrose (citometria de fluxo), foram avaliadas. Os resultados obtidos demonstraram que o composto TAHB3 foi capaz de induzir a neurodiferenciação das células PC12, havendo alterações morfológicas neuro-específicas, bem como aumento significativo na expressão do marcador neuronal β-III-tubulina. Nos ensaios de neuroproteção, nenhum dos compostos (TAHB3, TA8Amino, donepezila e tacrina) foi citotóxico para os neurônios diferenciados, sendo que testados isoladamente não reduziram a viabilidade e nem alteraram a cinética do ciclo celular; TAHB3 foi o único composto que exibiu potencial neuroprotetor frente aos danos oxidativos induzidos pelo H2O2 . Quanto à análise de indução de morte celular, observou-se que os tratamentos com os compostos isoladamente não aumentaram os níveis de morte; já em relação à neuroproteção, não foram obtidas diferenças significativas. Dessa forma, os resultados obtidos são interessantes e demonstram que o composto híbrido TAHB3 apresenta propriedades importantes na busca por novos candidatos a fármacos na terapia para a DA, por não ser citotóxico para as células PC12 diferenciadas em neurônios, além de apresentar potencial neuroprotetor frente a danos oxidativos e capacidade indutora de neurodiferenciação.

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease caused by progressive damage that compromises cognitive functions, behavior and memory. AD development may be due to several changes culminating in neuronal death. Among these alterations, the accumulation of beta-amyloid peptides, hyperphosphorylation of tau protein, oxidative stress and reduced levels of the neutrotransmitter acetylcholine (ACh) stand out. The treatments currently used for AD are based on acetylcholinesterase inhibitors (AChEIs); AChE is the enzyme responsible for the degradation of ACh. In this context, new hybrid compounds belonging to the AChEIs class were synthesized from donepezil and tacrine, which are drugs used in AD therapy. The hybrid compounds, TAHB3 and TA8Amino, have been studied in the present laboratory, under the hypothesis that they may have a neuroprotective capacity against oxidative damage, in addition to inducing neurodifferentiation. The aim of this work was to analyze the neuroprotective effects of TAHB3 and TA8Amino on PC12 cells, which were differentiated into neurons, against oxidative damage induced by hydrogen peroxide (H2O2), in addition to analysing their ability to induce the neurodifferentiation of PC12 cells. To assess the neurodifferentiation-inducing capacity, cells were treated for 7 days with AChEIs at a concentration close to the IC50, 5 µM for the hybrid compounds, and 10 µM for donepezil and tacrine. Neurodifferentiation was evaluated through morphological and quantitative analyses of the percentages of neuronal differentiation (proven by the expression of neuronal markers by immunofluorescence and Western Blot), as well as neurite length measurements. To evaluate the neuroprotective potential of the compounds, PC12 cells were differentiated into neurons using Neuronal Growth Factor - NGF for 7 days; after this, the cells were pre-treated with AChEIs and then subjected to treatment with H2O2. The cell viability (XTT assay), cell cycle kinetics and induction of cell death (by apoptosis and necrosis) were evaluated. The results showed that the TAHB3 compound was able to induce the neurodifferentiation of PC12 cells, with neurospecific morphological changes, as well as a significant increase in the expression of the β-III-tubulin neuronal marker. In neuroprotection assays, none of the compounds (TAHB3, TA8Amino, donepezil and tacrine) was cytotoxic to differentiated neurons, and when tested alone they did not reduce cell viability or change the cell cycle kinetics; TAHB3 was the only compound that exhibited neuroprotective potential against oxidative damage induced by H2O2. As for the analysis of cell death induction, it was observed that treatments with the compounds alone did not increase the levels of death; however, regarding neuroprotection, significant differences were not found. Thus, the results obtained are interesting and demonstrate that the hybrid compound TAHB3 has important properties in the search for new drug candidates in AD therapy, since this compound was not toxic to neuron-differentiated PC12 cells, in addition to presenting neuroprotective potential against oxidative damage and neurodifferentiation-inducing capacity.