O Câncer de Próstata (PCa) é o segundo tipo de câncer mais comum entre os homens. O curso da doença costuma ser positivo, mas uma parcela dos pacientes desenvolve a forma mais agressiva da doença, com uma taxa de recorrência que pode chegar a 30% dos pacientes tratados com prostatectomia radical. A irresponsividade a terapia de deprivação androgênica e a quimioterapia é uma causa significante de morbidade e mortalidade entre esses pacientes. Apesar da efetividade da imunoterapia em outros tipos tumorais, a resposta dessa abordagem em pacientes com a forma avançada do PCa foi aquém do esperado, com taxas de resposta de apenas 15%. Atualmente o mecanismo de evasão imune desse tipo tumoral ainda não é bem compreendido e não existem biomarcadores definitivos para estratificar pacientes que desenvolverão a forma agressiva da doença ou que responderão a imunoterapia. O PCa tem a capacidade de reativar um programa embriogênico chamado de Transição Epitélio-Mesenquimal (EMT), capaz de contribuir com o aumento da invasão, da migração, da resistência terapêutica e da metástase. Esse processo já foi previamente associado a evasão imune em outros tipos de tumores sólidos, mas no PCa a relação entre esses dois processos ainda não foi estudada. Nesse projeto nós investigamos o impacto da expressão do SNAI1 e do ZEB1, conhecidos marcadores de EMT, no perfil transcricional do PCa, em especial em genes e vias relacionados a resposta imune. Uma coorte de 51 pacientes de PCa submetidos a prostatectomia radical foi utilizada. As amostras do tumor fixadas em formalina e embebidas em parafina foram coletadas retrospectivamente. As regiões de interesse foram marcadas e cortes adjacentes foram enviados para o Ontario Institute of Cancer Research para extração de RNA e análise transcriptômica utilizando os painéis NanoString BC360, PanCancer Pathway, Immune profiling e Human V3 miRNA. As análises de expressão diferencial e enriquecimento de vias comparando os pacientes com maior expressão dos genes de interesse foi feita utilizando o painel Immune Profiling. A validação foi feita utilizando o painel PanCancer Pathway e uma coorte pública do TCGA. Os miRNAs enriquecidos e seus alvos foram investigados. A coorte do TCGA também foi utilizada para fazer a análise de citometria digital utilizando o algoritmo do CIBERSORT. O SNAI1 foi associado a um estadiamento patológico elevado e o ZEB1 a uma menor probabilidade de sobrevivência livre de recorrência. Ambos os marcadores foram associados a expressão de genes relacionados a uma maior agressividade como ETS1, COL3A1 e RUNX1, e a genes relacionados a evasão imune como CTLA4 e PD-L1. Complementarmente, vias pró-inflamatórias e pró-tumorigênicas se mostraram enriquecidas no grupo SNAI1 high. A análise utilizando o TCGA confirmou esses resultados. O grupo ZEB1 high se mostrou associados a um maior número de miRNA enriquecidos, dentre eles seis tem como alvo a própria via de EMT, o que sugere um mecanismo de feedback negativo eliciado pela expressão desse gene. Dados do TCGA ainda mostraram que ambos os genes estão associados a maior expressão de checkpoints imunológicos e a análise de citometria digital mostrou que a expressão de ambos os marcadores está associada a um enriquecimento de células quiescentes no microambiente tumoral. Além disso, a alta expressão de ZEB1 também se mostrou associada a uma depleção de células efetoras e a uma polarização M0-M2 de macrófagos associados ao tumor. Coletivamente esses dados sugerem que a EMT está associada não somente a uma maior agressividade do tumor, mas também a mecanismos de evasão imune, o que poderia explicar parcialmente a exclusão imunológica desse tumor e sugerir o uso desses genes como biomarcadores de resposta a imunoterapia.

Prostate Cancer (PCa) is the second most common type of cancer among men. The course of the disease is usually favorable. However, some patients develop the most aggressive form of the disease, with a recurrence rate of 30% for patients treated with radical prostatectomy. These patients are unresponsive to androgen deprivation therapy and chemotherapy, which is a significant cause of morbidity and mortality. Despite the effectiveness of immunotherapy in other tumor types, the response rate in patients with the advanced form of PCa has been disappointing, approaching only 15%. Currently, the immune evasion mechanisms of PCa are not well understood, and there are no definitive biomarkers to stratify patients who will develop an aggressive form of the disease or to predict who will respond to immunotherapy. Recently it has been shown that PCa can reactivate an embryogenic program called Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT), which is capable of contributing to increased invasion, migration, therapeutic resistance, and metastasis. The EMT process has previously been associated with immune evasion in other types of solid tumors, but in PCa, a definitive relationship between immune response and EMT has yet to be studied. In this project, we investigated the impact of SNAI1 and ZEB1 expression, known EMT markers, on the PCa transcriptional profile, especially on genes and pathways related to the immune response. A cohort of 51 PCa patients undergoing radical prostatectomy were used. Formalin-fixed, paraffin-embedded tumor samples were collected retrospectively. Regions of interest were marked, and adjacent sections were sent to the Ontario Institute of Cancer Research for RNA extraction and transcriptomic analysis using BC360, PanCancer Pathway, Immune profiling and Human V3 miRNA NanoString Panels. Differential expression and pathway enrichment analyses comparing patients with higher expression of the genes of interest were performed using the Immune Profiling panel. Validation was performed using the PanCancer panel Pathway and public domain TCGA data. The enriched miRNAs and their targets were investigated. TCGA data was also used to perform digital cytometry analysis using the CIBERSORT algorithm. SNAI1 was associated with elevated pathological staging and ZEB1 with a lower probability of recurrence-free survival. Both markers were associated with the expression of genes related to greater aggressiveness, such as ETS1, COL3A1 and RUNX1, and to immune evasion such as CTLA4 and PD-L1. Complementarily, pro-inflammatory and pro-tumorigenic pathways, such as inflammatory response and TNF signaling via NF- kB were enriched in the SNAI1 high group. Analysis using TCGA data also showed enrichment of complement, interferon-gamma and IL6/JAK/STAT3 signaling pathways. The ZEB1 high expression group was associated with a greater number of enriched miRNAs, among which six target the EMT pathway itself, which suggests a negative feedback mechanism elicited by the expression of this gene. TCGA data also showed that both genes are associated with greater expression of immunological checkpoints, and the analysis of digital cytometry showed that the expression of both markers is associated with an enrichment of quiescent cells, such as naïve B lymphocytes, in the tumor microenvironment. It was also found that high expression of ZEB1 was associated with a depletion of effector cells, such as CD8 lymphocytes, and a M0-M2 polarization of tumor-associated macrophages. Collectively, these data suggest that EMT is associated not only with greater tumor aggressiveness but also with mechanisms of immune evasion, which could partially explain the poor response of PCa to immunotherapy. It is suggested that the genes identified as being involved in immune pathways in this project may be promising expression biomarkers for the future use of checkpoint inhibitor drugs in PCa.