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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2021.tde-07022022-143645
Document
Author
Full name
Maria Paula Martins Januário
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2021
Supervisor
Committee
Ramos, Ester Silveira (President)
Engel, Edgard Eduard
Ferreira, Danilo Moretti
Title in Portuguese
Padrão de metilação do DNA da H19DMR em osteomielite
Keywords in Portuguese
Epigenética
Gene H19
Imprinting genômico
qPCR
Abstract in Portuguese
O gene H19 é considerado um importante supressor tumoral, está localizado no cromossomo 11, na região controladora de imprinting 1 (ICR1) e é controlado pela região diferencialmente metilada denominada de H19DMR. Foi descrito o seu envolvimento com a regeneração óssea e a sua expressão foi associada a um mau prognóstico em casos de osteossarcoma. Os processos proliferativos reparativos, como as osteomielites, apresentam potencial para transformações malignas. O objetivo deste trabalho foi analisar o padrão de metilação da H19DMR na osteomielite e sua associação com o prognóstico da doença. Foram selecionadas, no Laboratório de Genética e Câncer - UNESP - Botucatu, amostras de sangue e de lesões coletadas durante cirurgias. Foram obtidas, em estudos citogenéticos anteriores, células em suspenção a partir de cultura de células das amostras das lesões. O DNA foi extraído das células de sangue periférico e do material fixado das lesões utilizado para o estudo citogenético. O padrão da metilação do DNA da H19DMR foi observado utilizando-se a técnica de PCR em tempo real associada à enzima de restrição sensível à metilação. Foram selecionados quatro casos, sendo um de oesteomielite crônica com progressão mais agressiva para fibrosarcoma (Caso 1), o qual apresentava, entre outras alterações cromossômicas, monossomia do cromossomo X e 11; mais dois de osteomielite (Casos 2 e 3), sendo que no Caso 2 foi possível a análise citogenética com várias alterações clonais; e um caso de fibrossarcoma (Caso 4), uma neoplasia óssea e não osteomielite, para comparação, devido à progressão do Caso 1. O mosaicismo contendo células com monossomia do cromossomo X clonal não foi detectado pela eletroforese capilar, o que mostra que a citogenética tradicional ainda pode trazer resultados relevantes não detectados por outras técnicas. Nos Casos 1, 3 e 4 foi constatada a hipometilação da H19DMR proporcional à gravidade dos casos. Como a metilação estaria relacionada a uma menor expressão do gene, o esperado seria a hipermetilação nos casos de pior prognóstico, uma vez que o papel de supressor tumoral seria o de diminuir a progressão. No entanto, foi obtido o resultado inverso. Embora o número pequeno de amostras analisadas, os resultados obtidos de um provável aumento da expressão do H19, devido à sua hipometilação, poderia corresponder a uma tentativa de regeneração óssea, papel que já tem sido relacionado a este gene e mostraria um potencial de utilização da H19DMR como biomarcador.
Title in English
DNA methylation pattern of H19DMR in osteomyelitis
Keywords in English
Epigenetics
Gene H19
Genomic imprinting
qPCR
Abstract in English
The H19 gene is considered an important tumor suppressor, is located on chromosome 11, in the controlling region of imprinting 1 (ICR1) and is controlled by the differentially methylated region called H19DMR. Its involvement with bone regeneration has been described and its expression has been associated with a poor prognosis in cases of osteosarcoma. Reparative proliferative processes, such as osteomyelitis, have the potential for malignant transformations. The aim of this study was to analyze the methylation pattern of H19DMR in osteomyelitis and its association with the prognosis of the disease. Blood and lesion samples collected during surgeries were selected at the Laboratory of Genetics and Cancer - UNESP - Botucatu. In previous cytogenetic studies, cells were obtained from cell culture of the samples of the lesions. DNA was extracted from peripheral blood cells and from the fixed material of the lesions used for cytogenetic study. The h19DMR DNA methylation pattern was observed using the real-time PCR technique associated with the methylation-sensitive restriction enzyme. Four cases were selected, one of chronic osteomyelitis with more aggressive progression (Case 1), which presented, among other chromosomal alterations, monosomy of chromosome X and 11; two more osteomyelitis (Cases 2 and 3), and in case 2 it was possible to analyze cytogenetics with several clonal alterations; and one case of fibrosarcoma (Case 4), a bone neoplasm and not osteomyelitis, for comparison. Mosaicism containing cells with clonal X chromosome monosomy was not detected by capillary electrophoresis, which shows that traditional cytogenetics can still bring relevant results not detected by other techniques. In Cases 1, 3 and 4, hypomethylation of H19DMR proportional to the severity of the cases was found. As methylation would be related to a lower gene expression, hypermethylation would be expected in cases of worse prognosis, since the role of tumor suppressor would be to decrease progression. However, the opposite result was obtained. Although the small number of samples analyzed, the results obtained from a probable increase in H19expression, due to its hypomethylation, could correspond to an attempt at bone regeneration, a role that has already been related to this gene and would show a potential use of H19DMR as a biomarker.
 
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Publishing Date
2022-02-16
 
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