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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2021.tde-05112021-105440
Documento
Autor
Nome completo
Cinthia Caroline Alves
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2021
Orientador
Banca examinadora
Giuliatti, Silvana (Presidente)
Leitão, Andrei
Mendes Junior, Celso Teixeira
Silva, Marco Antonio Alves da
Título em português
Caracterização estrutural do polimorfismo -964G>A na interação do fator de transcrição HIF1 com seu elemento regulatório na região promotora do gene HLA-G
Palavras-chave em português
Docking molecular
MHC de classe I
Proteína-DNA
Resumo em português
O gene do Antígeno leucocitário humano-G (HLA-G, do inglês, Human Antigen Leukocyte-G) codifica uma molécula reguladora do sistema imunológico com expressão tecidual restrita em condições fisiológicas; entretanto, o gene pode ser induzido em condições de hipóxia pela interação com o fator induzível por hipóxia 1 (do inglês, Hypoxia Inducible Factor 1, HIF1). Os elementos responsivos à hipóxia (do inglês, Hypoxia Responsive Element, HRE) localizados na região promotora (posição -966 a -962) e no éxon 2 são os principais elementos regulatórios alvos do HIF1. O alelo G no sitio polimórfico -964 G>A induz maior expressão de HLA-G quando comparado ao alelo A em situações de baixo teor de oxigênio. Uma vez que a variabilidade genômica do HLA-G pode influenciar a formação do complexo HIF1-HRE, neste estudo foi analisado a interação física do complexo á nível de pares de átomos considerando ambos os alelos -964G e -964A, usando abordagens computacionais. O cristal do heterodímero HIF2 de camundongo (Protein Data Bank ID: 4ZPK, 3,6Å-https://www.rcsb.org/) que pertence à mesma família de proteínas que o HIF1, foi usado como molde para realizar a modelagem molecular por homologia da estrutura quaternária do HIF1 humano. A estrutura primária do HIF1 humano que abrange os resíduos 15 a 349 para a subunidade HIF1a, e 87 a 470 para a subunidade ARNT (UniProt ID: Q16665 e P27540, respectivamente-https://www.uniprot.org/) foi recuperada do banco de dados UniProt. Definidos o molde e o alvo, o software MODELLERv9.24 foi usado para a modelagem molecular por homologia. O modelo mais semelhante estruturalmente ao molde foi avaliado de acordo com a qualidade físico-química e estereoquímica da proteína. Duas estruturas 3D de DNA foram construídas a partir da sequência 5'GCRTG'3 do HRE contendo o alelo -964G ou -964A na posição "R" usando o software x3DNA. O docking molecular proteína-DNA foi realizado usando o servidor HADDOCKv2.4, e as interações intermoleculares foram calculadas pelo servidor DNAproDB. A simulação de dinâmica molecular foi realizada para a proteína livre e os complexos proteína-DNA por 200 ns usando o software Gromacs v.2019. A partir das coordenadas atômicas da trajetória foi calculado os parâmetros inter-base pair steps do DNA pelo programa Curves v.2.6. O modelo do HIF1 mais semelhante ao molde gerado por modelagem comparativa obteve o RMSD mais baixo (0,396Å) após o alinhamento das estruturas em comparação com outros modelos, e apresentou 87,2% dos resíduos na região central dos ângulos de torção phi-psi, enquanto o molde apresentou 80,10%. A ligação do HIF1 com o HRE contendo o alelo -964 G resultou na formação de mais ligações de hidrogênio e contatos de Van der Waals do que HRE com alelo -964 A. A análise das trajetórias do complexo RMSD proteína-DNA revelou que o complexo HIF1-HRE-964G é mais estável. Em conclusão, o HIF1 se liga de maneira mais estável e específica no HRE com o alelo G.
Título em inglês
Structural characterization of the -964G>A polymorphism in the interaction of HIF1 transcription factor with its regulatory element in the promoter region of the HLA-G gene
Palavras-chave em inglês
MHC class I
Molecular docking
Protein-DNA
Resumo em inglês
Human Antigen Leukocyte-G (HLA-G) gene encodes an immune checkpoint molecule that has restricted tissue expression in physiological conditions; however, the gene may be induced in hypoxic conditions by the interaction with the hypoxia inducible factor-1 (HIF1). Hypoxia responsive elements (HRE) located into HLA-G promoter region (-966 and -962 nucleotides) and exon 2 are the major HIF1 target sites. The G allele of the -964 G>A transversion induces higher HLA-G expression when compared to the A allele in hypoxic conditions. Since HLA-G variability may influence the HIF1-HRE binding, we analyzed this complex interaction at the atomistic level considering both -964G and -964A alleles, using computational approaches. Mouse HIF2 dimer crystal (Protein Data Bank ID: 4ZPK, 3.6Å-https://www.rcsb.org/) that belongs to the same HIF1 protein family was used as template to perform homology modelling of human HIF1 quaternary structure, which encompasses residues 15-349 to HIF1a subunit and 87-470 to ARNT subunit (UniProt ID: Q16665 and P27540, respectively-https://www.uniprot.org/), using MODELLER v.9.24. The most similar template structural model was evaluated according to protein physical-chemical and stereochemical quality. Two 3D DNA structures were built from 5'GCRTG'3 HRE sequence containing the -964G or -964A allele at "R" position using x3DNA v.2.4. Protein-DNA docking was performed using HADDOCK v2.4, and complex intermolecular interactions were computed by DNAproDB server. Molecular dynamic simulation was carried out to protein and protein-DNA complexes per 200 ns using Gromacs v.2019. Inter bp step from DNA atomic coordinate trajectories were calculated by Curves v.2.6 program. HIF1 most similar template model generated by homology modeling showed the lowest RMSD of 0.396Å after template alignment in comparison to other models, and it presented 87.2% of the residues in the core region of phi-psi torsion angles, while template presented 80.10%. HIF1 binding in the HRE containing -964 G allele results in more hydrogen bonds and Van der Waals contacts formation than HRE with -964 A allele. RMSD protein-DNA complex trajectories analysis reveal that HIF1-HRE-964G complex is more stable than HIF1-HRE complex with A aelle. In conclusion, HIF1 binds in a more stable and specific manner in the HRE with G allele.
 
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Data de Publicação
2021-11-19
 
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