O desenvolvimento sexual é um processo complexo que envolve muitos fatores, em especial, genéticos e ambientais. Compreender o desenvolvimento testicular em aves durante a embriogênese é importante para o aprimoramento do conhecimento em diversas áreas, desde o desenvolvimento sexual humano até a conservação das espécies. A metilação do DNA é um importante mecanismo epigenético envolvido na regulação da expressão gênica e está envolvida com a gonadogênese. Em mamíferos, o início da regulação epigenética do testículo foi descrito após a determinação do sexo, porém ainda não se sabe ao certo como as enzimas envolvidas com os processos epigenéticos atuam. A galinha é um bom modelo animal de estudo de genes envolvidos na regulação epigenética. Nosso objetivo foi inicialmente investigar a expressão de genes responsáveis pela metilação e desmetilação do DNA em diferentes estágios do desenvolvimento testicular de embriões de Gallus gallus domesticus, bem como identificar possíveis regiões reguladoras da metilação do DNA em genes envolvidos na diferenciação testicular. Foram utilizados ovos fertilizados de galinha, e as amostras de testículos foram coletadas de embriões durante diferentes estágios do desenvolvimento gonadal (HH32, HH35, HH38, HH41 e HH45). O RNA total foi isolado para posterior síntese de cDNA. A expressão de seis genes alvo, sendo três que codificam DNA metiltransferases (DNMT1, DNMT3A e DNMT3B) e três que codificam DNA desmetilases Ten-eleven-translocation (TET1, TET2 e TET3), foi avaliada por RT-qPCR usando SYBR™ Green. β-actina e Proteína Ribossômica L5 (RPL5) foram usados como genes de referência. Em seguida, as ilhas CpGs foram identificadas nas regiões promotoras dos genes marcadores de diferenciação do testículo DMRT1, AMH e SOX9 utilizando o Programa MethPrimers, e uma rede de interação gênica foi construída utilizando o software STRING v10. No estágio HH32, houve aumento na expressão dos genes TET1 e TET3. Já os genes DNMT3B e TET2 apresentaram aumento significativo nos estágios finais HH41 e HH45. O gene DNMT1 apresentou expressão significativa no início, meio e fim da diferenciação testicular. Nossos resultados sugerem que os genes analisados desempenham um papel relevante na regulação epigenética ao longo do desenvolvimento do testículo, e poderão contribuir com informações significativas sobre esse processo para aves. Nossas análises mostraram evidências de ilhas CpGs nas regiões promotoras dos genes DMRT1, AMH e SOX9, e a rede de interação gênica sugere uma forte ligação entre eles.

Sexual development is a complex process that involves many factors, especially genetic and environmental. Understanding testicular development in birds during embryogenesis is important for improving knowledge in diverse areas, from human sexual development to species conservation. DNA methylation is an important epigenetic mechanism involved in the regulation of gene expression and is involved in gonadogenesis. In mammals, the timing of testis epigenetic regulation has been described after sex determination, but it is not yet known how epigenetic enzymes act in this process. Chicken is a good model for studying genes involved in epigenetic reprogramming during testis development. Our objective was to investigate the expression of genes responsible for DNA methylation and demethylation in different stages of testis development in Gallus Gallus domesticus male embryos, as well as to identify possible regulatory regions of DNA methylation in genes involved in testicular differentiation. Fertilized chicken eggs were analyzed, and testes samples were collected from chicken embryos during different stages of gonadal development (HH32, HH35, HH38, HH41, and HH45). Total RNA was isolated for further cDNA synthesis. The expression of six target genes, three genes that encode DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) and three genes that encode DNA demethylases Ten-eleven-translocation (TET1, TET2 and TET3), was assessed by RT-qPCR using SYBR™ Green system. We used β-actina and Ribosomal Protein L5 as reference genes. Then, CpGs islands were identified in the promoter regions of the DMRT1, AMH and SOX9 genes using the MethPrimers Program, and a gene interaction network was built using the STRING v10 software. In stage HH32, there was an increase in the expression of the TET1 and TET3 genes. The DNMT3B and TET2 genes showed a significant increase in the final stages HH41 and HH45. The DNMT1 gene showed significant expression at the beginning, middle and end of testicular differentiation. Our results suggest that the analyzed genes play an important role in epigenetic regulation throughout testis development and may contribute with significant information about this process for birds. Our analyzes showed evidence of CpG islands in the promoter regions of DMRT1, AMH and SOX9 genes, and the gene interaction network suggests a strong link between them.