A Doença de Gaucher (DG) é caracterizada pela deficiência da enzima lisossomal glicocerebrosidase (GCase). A terapia de reposição enzimática é considerada o padrão ouro no tratamento da DG. No Brasil, três enzimas recombinantes fazem parte do protocolo clínico e diretrizes terapêuticas para DG. Entretanto, essas enzimas são importadas e o país carece de autonomia no desenvolvimento de GCase. Por meio de evolução dirigida in silico, em estudos anteriores do nosso laboratório, foram desenvolvidas cinco variantes do gene GBA1 com códons otimizados e mutações missenses sítio-específicas que codificam cinco variantes de GCase humana recombinante: GBA-opt, GBA-7, GBA-8, GBA-9 e GBA-12. Como continuidade desses estudos, este projeto teve como objetivo caracterizar e selecionar dentre as cinco variantes, aquela mais promissora para ser utilizada no tratamento da DG. Por abordagem in silico foi realizada a predição das estruturas secundárias e terciárias do mRNA das cinco variantes. Em sequência, por ensaios in vitro, foram geradas 150 linhagens celulares humanas transgênicas com produção transiente de GCase humana recombinante: 60 para análise da expressão relativa do mRNA de GCase por RT-qPCR; 40 para avaliação da eficiência de transfecção por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo após co-transfecção de construções plasmidiais contendo cDNA que codifica as variantes de GCase e cDNA que codifica a proteína verde fluorescente (GFP); e 50 para mensuração da atividade enzimática de GCase biologicamente ativa por meio de ensaio fluorimétrico. Dos resultados obtidos destacam-se seis: (1) a otimização de códons promoveu um aumento da estabilidade termodinâmica da estrutura secundária do mRNA de GCase humana com energia mínima livre 7,200 kcal/mol mais negativa na molécula otimizada (GBA-opt) (-832,470 ±4,970 kcal/mol) em comparação a GCase humana selvagem (-825,430 ±2,570 kcal/mol); (2) a estrutura secundária do mRNA da variante GBA-7 é a mais estável entre as variantes, com energia mínima livre de -844,000 ±4,860 kcal/mol; (3) o promotor hEF1a é mais eficiente na expressão do mRNA das variantes GBA-opt, GBA-7, GBA-9 e GBA-12 em comparação ao promotor CMV; (4) os níveis de expressão dos mRNAs das variantes GBA-7 e GBA-9 relativo ao gene referência RNAr 18S foram 16 x10⁶ (±2,9 x10⁶) e 11 x10⁶ (±0,9 x10⁶) Unidades relativas de expressão (URE) quando comparado com o mRNA GBA-opt 3 x10⁶ (±0,5 x10⁶) URE; (5) por meio do ensaio de co-transfecção plasmidial observou-se que a eficácia da transfecção foi similar entre as linhagens celulares humanas transgênicas geradas; (6) no que se refere a atividade específica de GCase, as linhagens celulares humanas transgênicas 293-FT_hEF1a-GBA-7+ e 293-FT_hEF1a-GBA-opt+ apresentaram níveis de 496,000 ±69,800 e 429,050 ±63,800 nmol de substrato hidrolisado/mg proteina/h enquanto as células não transfectadas apresentaram níveis da ordem de 128,700 ±8,400 nmol/mg/h. Concluímos que otimização de códons e mutações missenses sítio-específicas, determinadas por estudos de evolução dirigida in silico, favorecem a expressão do mRNA de enzimas GCase humana recombinantes in vitro. Demonstramos que GBA-7 é uma variante promissora para futuros estudos que visam aumentar a produção de GCase recombinante para obter uma terapia de reposição enzimática para DG de desenvolvimento nacional.

Gaucher disease (GD) is characterized by a deficiency of the lysosomal enzyme glucocerebrosidase (GCase). Enzyme replacement therapy is considered the gold standard in the treatment of GD. In Brazil, three recombinant enzymes are part of the clinical protocol and therapeutic guidelines for DG. However, these enzymes are imported, and the country needs more autonomy in GCase development. Through directed evolution in silico, in previous studies in our laboratory, five variants of the GBA1 gene were developed with optimized codons and site-specific missense mutations that encode five variants of recombinant human GCase: GBA-opt, GBA-7, GBA-8, GBA-9, and GBA-12. As a continuation of these studies, this project aimed to characterize and select among the five variants the most promising one to be used in the treatment of GD. By in silico approach, the secondary and tertiary mRNA structures of the five variants were predicted. Subsequently, by in vitro assays, 150 transgenic human cell lines with transient production of recombinant human GCase were generated: 60 for analysis of relative GCase mRNA expression by RT-qPCR; 40 for evaluation of transfection efficiency by fluorescence microscopy and flow cytometry after co-transfection of plasmid constructs containing cDNA encoding GCase variants and cDNA encoding the green fluorescent protein (GFP), and 50 for measurement of biologically active GCase enzymatic activity by fluorimetric assay. Of the results obtained six are highlighted: (1) codon optimization promoted an increase in thermodynamic stability of the secondary structure of human GCase mRNA with 7.200 kcal/mol more negative minimum free energy in the optimized molecule (GBA-opt) (-832.470 ±4.970 kcal/mol) compared to wild-type human GCase (-825.430 ±2.570 kcal/mol); (2) the secondary structure of the GBA-7 variant mRNA is the most stable among the variants, with minimum free energy of -844.000 ±4.860 kcal/mol; (3) the hEF1a promoter is more efficient in mRNA expression of the GBA-opt, GBA-7, GBA-9 and GBA-12 variants compared to the CMV promoter; (4) the expression levels of the mRNAs of GBA-7 and GBA-9 variants relative to the reference 18S rRNA gene were 16 x10⁶ (+2.9 x10⁶) and 11 x10⁶ (+0.9 x10⁶) relative expression units (URE) when compared to the GBA-opt mRNA 3 x10⁶ (+0.5 x10⁶) URE; (5) by plasmid co-transfection assay it was observed that the transfection efficiency was similar among the generated transgenic human cell lines; (6) with regard to specific GCase activity, the 293-FT_hEF1a-GBA-7+ and 293-FT_hEF1a-GBA-opt+ transgenic human cell lines showed levels of 496.000 ±69.800 and 429.0500 ±63.800 nmol hydrolyzed substrate/mg protein/h, while the untransfected cells showed levels of 128.700 ±8.400 nmol/mg/h. We conclude that codon optimization and site-specific missense mutations, determined by in silico-directed evolution studies, favor mRNA expression of recombinant human GCase enzymes in vitro. We demonstrate that GBA-7 is a suitable variant for future studies to increase recombinant GCase production to obtain a national enzyme replacement therapy.