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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.17.2017.tde-04012017-100252
Document
Author
Full name
Lara Elis Alberici Delsin
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2016
Supervisor
Committee
Tone, Luiz Gonzaga (President)
Castelo, Ademilson Panunto
Engel, Edgard Eduard
Smith, Marilia de Arruda Cardoso
Title in Portuguese
Avaliação de microRNAs associados às quinases ROCK em osteossarcoma e seu papel no processo de invasão celular
Keywords in Portuguese
miR-708-5p
Osteossarcoma
ROCK
Abstract in Portuguese
Osteossarcoma (OS) é uma neoplasia que acomete principalmente as metáfises de ossos longos, sendo o tumor ósseo pediátrico mais comum. O tratamento consiste em ressecção cirúrgica, tratamento quimioterápico multimodal neo-adjuvante e adjuvante. No entanto, apesar dos tratamentos, cerca de 80% dos pacientes que apresentam metástase tem uma sobrevida curta. Deste modo, torna-se necessário um melhor entendimento do processo metastático, assim como da busca por novos alvos terapêuticos. Uma das principais vias relacionada à invasão e migração das células neoplásicas é a das GTPases Rho, cujas principais moléculas efetoras são as quinases ROCK1 e 2, responsáveis por mediar a migração através do controle do citoesqueleto. Tais quinases têm sido relatadas hiperexpressas em diversas neoplasias e associadas ao pior prognóstico. Recentemente, pesquisas também têm apontado a desregulação de miRNAs na tumorigênese, sendo que a hipoexpressão de alguns microRNAs estão relacionados à hiperexpressão das ROCKs e, portanto, envolvidos no processo metastático. No presente trabalho, estudou-se a expressão tanto das ROCKs quanto de miRNAs associados a elas em amostras tumorais de OS por meio de PCR em tempo real. Encontramos uma hipoexpressão de ROCK1 nas amostras OS quando comparadas ao osso não neoplásico controle, enquanto que ROCK2 não apresentou diferença. O miR-138 foi encontrado hiperexpresso e obteve correlação com ROCK2, além de associação com a sobrevida. Os miR-139 e miR-708 demonstraram-se hipoexpressos nas amostras tumorais. Já os miR-196b e miR-584 não apresentaram diferenças. Após as análises de expressão, optou-se pelo estudo do miR-708 em linhagens de OS, desta forma, sua expressão foi induzida em três linhagens celulares, através de um vetor lentiviral, e foram realizados ensaios funcionais com o objetivo de estabelecer o papel deste miRNA. Não foi observada diferença nas taxas de proliferação ou capacidade clonogênica quando a expressão do miR-708 foi indizida. No ensaio de migração wound healing o miR-708 reduziu a migração da linhagem SAOS-2, enquanto que no ensaio de invasão induziu a invasão da linhagem MG-63 em matrigel, mas reduziu esse potencial nas linhagens HOS e SAOS-2 na matriz de gelatina. Uma análise in silico dos alvos deste miRNA apontou sua associação às vias WNT, MAPK e de Junções Aderentes. Desta forma, sugere-se que o miR-708 pode estar envolvido no controle processos que levam ao desenvolvimento de metástase, principalmente na interação com a matriz extracelular.
Title in English
Evaluation of the expression of microRNAs associated with ROCK kinases and their role in the invasion process in osteosarcoma
Keywords in English
miR-708-5p
Osteosarcoma
ROCK
Abstract in English
Osteosarcoma (OS) is a neoplasia that mainly occurs at the metaphyses of long bones, being the most common pediatric bone tumor. The treatment is based on surgical resection and the multimodal chemoterapy adjuvant and neoadjuvant. However, despite the treatment, around 80% of patients who evolve to metastais present a poor survival. Therefore, understanding the metastatic process is essencial, as well as the search for new therapy targets. The mainly pathway related to invasion and migration in neoplasic cells is regulated by the Rho GTPases, and their main effectors are the kinases ROCK1 and ROCK2, which are responsible for cytoskeleton control. The hyperexpression of these kinases has been described in different cancers and it has been associated to poor prognostic. In parallel, several studies have extensively demonstrated miRNA deregulation in tumorigenesis, and the hipoexpression of some miRNA are related to ROCK upregulation, consequently, involved with metastasis. Herein, we studied the expression profiles of ROCK1 and 2 and associated miRNAs in OS tumor samples by means of qRT-PCR. We found downregulation of ROCK1 in OS samples when compared to normal bone (control), while ROCK2 did not show differences. MiR-138 showed hiperexpression and was correlated with ROCK2, and an association with survival rates. MiR-139 and miR-708 were found downregulated in tumor samples, though miR- 196b and miR-584 did not show differences in expression. Afterwards, miR-708 expression was induced in three OS cell lines, aiming establish miR-708 role. Proliferation and clonogenic essays did not present any effects when miR-708 was induced. In the wound healing essay, miR-708 reduced the migration of SAOS-2 cells, and in invasion essay, miR-708 induced invasion of MG-63 cells in a matrigel matrix, while reduced the invasive potential of HOS and SAOS-2 cell lines in a gelatin matrix. An in silico analysis of miR-708 targets highlighted its association with WNT, MAPK and Adherent Junction pathways. Therefore, we suggest that miR-708 can be involved in process that leads to metastasis, mainly related to extracellular matrix interation.
 
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Publishing Date
2017-03-30
 
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