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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2020.tde-03112020-115800
Document
Author
Full name
Amanda Cristina Corveloni
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2020
Supervisor
Committee
Panepucci, Rodrigo Alexandre (President)
Castro, Virgínia Picanço e
Fontes, Aparecida Maria
Moreira, Lílian Figueiredo
Title in Portuguese
Mecanismos moleculares envolvidos na transição entre o estado primed e naïve de células-tronco embrionárias
Keywords in Portuguese
Células-tronco embrionárias
Naïve
Notch
Pluripotência
Primed
Abstract in Portuguese
Células-tronco embrionárias (CTE) pluripotentes são definidas como células com potencial de diferenciação para os três folhetos embrionários (ectoderma, mesoderma e endoderma). CTE pluripotentes de camundongos (mESCs) são consideradas possuidoras de um estado de pluripotência "naïve", definida pela habilidade de se auto-renovar, mantendo o potencial de diferenciação (sem tendências), enquanto as células do epiblasto (EpiSCs) formado após a implantação sofrem mudanças marcantes, tornando-se preparadas (primed) para responder a sinais indutores de diferenciação. As CTE humanas (hESCs) são consideradas, com base em características transcricionais, morfológicas e de dependência de vias de sinalização, mais próximas das EpiSCs de camundongo do que das mESCs, compreendidas como no estado primed. Nosso grupo mostrou recentemente que o miR-363 promove a pluripotência em hESCs por inibição pós-transcricional de componentes da sinalização de Notch. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da via de sinalização Notch no contexto dos estados naïve e primed de pluripotência em hESCs. Para isso foram utilizadas as linhagens de CTEh H1 e H9, e foram explorados diversos métodos de conversão do estado primed para naïve in vitro, com inibidores (LIF-5i/3i) com dois meios distintos e com meio comercial RSeT(TM) em condições de hipóxia e normóxia, além da inibição da sinalização de Notch com um inibidor da gama-secretase (DAPT). Foram avaliados parâmetros característicos de cada estado (marcadores de superfície e genes associados aos estados primed e naïve) por microscopia de imunofluorescência quantitativa (High Content Analysis/Microscopy), citometria de fluxo e expressão gênica. As alterações sobre esses marcadores variaram de acordo com o método de conversão utilizado, porém as alterações mais marcantes foram o aumento dos transcritos de DPPA3 e KLF4, importantes genes associados ao estado naïve, efeito também provocado pela inibição a sinalização de Notch em diferentes abordagens avaliadas. Adicionalmente ainda foi observado um aumento do transcrito de DNMT3L (também importante marcador naïve) e a diminuição da marcação de H3K27me3 nas condições de cultura naïve assim como com a inibição da sinalização de Notch. Nossos dados demonstram que inibição da sinalização de Notch regula positivamente a rede transcricional relacionada ao estado naïve, além de possivelmente estar relacionado a uma modulação epigenética, sustentando nossa hipótese que a sinalização de Notch está envolvida no processo de transição primed/naïve, no entanto o mecanismo por qual atua ainda não totalmente elucidado. Demonstramos, ainda, que a associação de uma droga inibidora da sinalização de Notch pode ser explorada como um método mais eficaz para o processo de transição primed/naïve in vitro.
Title in English
Molecular mechanisms involved in the transition between the primed and naïve state of embryonic stem cells
Keywords in English
Embryonic stem cells
Naïve
Notch
Pluripotency
Primed
Abstract in English
Pluripotent embryonic stem cells (ESCs) are defined as cells with differentiation potential for the three embryonic leaflets (ectoderm, mesoderm and endoderm). Mouse pluripotent ESCs (mESCs) are considered to have a "naïve" pluripotent state, defined by the ability to self-renew, maintaining the potential for differentiation (without tendencies), while the epiblast cells (EpiSCs) formed after implantation undergo marked changes, becoming "primed" to respond to differentiating inducing signals. Human ESCs (hESCs) are considered, based on transcriptional, morphological and signaling-dependent characteristics, closer to mouse EpiSCs than to mESCs, understood as in the primed state. Our group recently showed that miR-363 promotes pluripotency in hESCs by post-transcriptional inhibition of Notch signaling components. Thus, the objective of this work was to evaluate the role of the Notch signaling pathway in the context of the naïve and primed states of pluripotency hESCs. For this, hESCs cell lines H1 and H9 were used, and several methods of conversion from primed to naïve state were explored, with inhibitors (LIF-5i/3i) with two different culture mediums and with commercial medium RSeT (TM) in hypoxia and normoxic conditions, in addition to inhibiting Notch signaling with a gamma secretase inhibitor (DAPT). Characteristic parameters of each state (surface markers and genes associated with primed and naïve states) were evaluated by quantitative immunofluorescence microscopy (High Content Analysis/Microscopy), flow cytometry and gene expression. The changes on these markers varied according to the conversion method used, but the most striking changes were the increase in DPPA3 and KLF4 transcripts, important genes associated with naïve status, an effect also caused by the inhibition of Notch signaling in different evaluated approaches. Furthermore, an increase in the DNMT3L transcript (also an important naïve marker) and a decrease in the H3K27me3 labeling under naïve culture conditions were observed, as well as with the inhibition of Notch signaling. Our data demonstrate that inhibition of Notch signaling positively regulates the transcriptional network related to the naïve state, in addition to possibly being related to an epigenetic modulation, supporting our hypothesis that Notch signaling is involved in the primed / naïve transition process, however the mechanism by which it acts has not yet been fully elucidated. We also demonstrate that the association of a drug that inhibits Notch signaling can be explored as a more effective method for the primed/naive transition process in vitro.
 
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Publishing Date
2021-01-27
 
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