Durante o início do desenvolvimento embrionário, alguns momentos são fundamentais para o sucesso da gestação, como a reprogramação epigenética que ocorre ainda em período pré-implantacional e a correta regulação das regiões controladoras de imprinting (ICRs). Humanos e bovinos possuem duas ICRs denominadas H19DMR e KvDMR1 localizadas no cromossomo autossomo 11 e 29, respectivamente, que possuem alta similaridade e, alterações epigenéticas nestas regiões podem levar ao desenvolvimento de fenótipos e síndromes semelhantes em ambas as espécies. Portanto, é de suma importância entender a regulação dos genes controlados por essas ICRs, assim como o perfil de metilação do DNA. Uma ferramenta útil para avaliar esses processos é a produção in vitro de embriões. O objetivo deste trabalho foi avaliar a metilação da H19DMR e KvDMR1, e a expressão dos genes controlados por imprinting controlados por elas, assim como a expressão de genes relacionados ao controle da metilação, desmetilação do DNA e diferenciação celular durante a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário inicial. Para tanto, foram coletados oócitos em estadio de vesícula germinativa (VG) antes e metáfase II (MII) após maturação in vitro. Embriões bovinos foram produzidos in vitro e diferentes estadios de desenvolvimento foram coletados, dentre eles zigoto, embrião 4-células, 8-células, mórula e blastocistos expandidos (Bx). A expressão dos genes localizados na ICR1 (H19 e IGF2) e na ICR2 (CDKN1C, KCNQ1, KCNQ1OT1 e PHLDA2), assim como dos genes envolvidos na metilação (DNMT1, DNMT3a e DNMT3b), desmetilação do DNA (TET1, TET2 e TET3) e pluripotência (OCT4 e NANOG) foram avaliadas utilizando RT-qPCR, enquanto a metilação da H19DMR e da KvDMR1 foi avaliada por sequenciamento de nova geração após conversão com bissulfito de sódio. A análise estatística do padrão de expressão gênica foi realizada utilizando teste ANOVA e post-hock Tukey. Como esperado, a expressão dos genes localizados na H19DMR e KvDMR1 variaram durante a maturação oocitária e início do desenvolvimento embrionário. Os genes da família DNMTs e TETs também apresentaram variações na expressão nos estadios avaliados, além de apresentarem um padrão de expressão que está de acordo com a reprogramação epigenética que ocorre no início do desenvolvimento embrionário. Os genes relacionados à pluripotência, OCT4 e NANOG, apresentaram maior expressão em mórula, ou seja, no início da diferenciação celular nas duas primeiras linhagens celulares do embrião, a massa celular interna e trofectoderma. Além disso, NANOG não foi detectado em oócitos e em zigoto. A análise da H19DMR mostrou manutenção de hipermetilação em todos os estadios avaliados, com exceção de 8-células e mórula que estavam parcialmente metilados. Por outro lado, a KvDMR1 se manteve hipermetilada durante a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário, com exceção do estadio de Bx que estava parcialmente metilado. Os resultados obtidos mostram que existe uma ampla variação na regulação dos genes controlados pelas ICRs. Por fim, os achados deste trabalho contribuem para o enriquecimento do conhecimento acerca da maturação oocitária e desenvolvimento pré-implantacional em bovinos.

During early embryo development, several moments are fundamental to the pregnancy success, as the epigenetic reprogramming that occurs during preimplantation development and the correct regulation of imprinting control regions (ICRs). Human and cattle have two ICRs denominated H19DMR and KvDMR1 on chromosome 11 and 29 respectively, that present high level of similarities and, epigenetics alterations in these regions leads to similar phenotypes on both species. Therefore, understand the regulation of genes controlled by these ICRs and its DNA methylation profile is of major importance. To study these moments, in vitro production (IVP) of embryos is a useful tool. In this study, we aimed to evaluate the H19DMR and KvDRM1 methylation and the expression of the imprinted genes controlled by them, as the expression of genes related to the control of DNA methylation and demethylation and cell differentiation on bovine oocytes and during early embryo development. During IVP, oocytes were collected before (germinal vesicle, or GV) and after (metaphase II, or MII) in vitro maturation and embryos were collected in five different stages during in vitro culture: single-cell, 4-cells, 8-cells, morula, and expanded blastocysts. The expression pattern was analyzed by qPCR on three different groups: imprinted genes (IGF2, H19, CDKN1C, KCNQ1 KCNQ1OT1 and PHLDA2), DNA methylation and demethylation genes (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, TET1, TET2 and TET3) and pluripotency genes (OCT4 and NANOG). The H19DMR and KvDMR1 methylation were evaluated by next generation sequence after bisulfite DNA conversion. Statistical analysis was realized using ANOVA followed by Tukey post-hoc test, considering a level of significance of 5%. As expected, the expression of the genes located on H19DMR and KvDMR1 changed during oocyte maturation and early embryo development. The DNMTs and TETs genes also presented alterations in their expression, in accordance with epigenetic reprogramming that occurs in early embryo development. The pluripotency genes, OCT4 and NANOG, presented the higher expression level on morula stage, in accordance with the beginning of cell differentiation into inner cell mass and trophectoderm. The H19DMR analysis shown a hypermethylation maintenance in all evaluated stages, with exception of 8-cell and morula that were partially methylated. On the other hand, the KvDMR1 was hypermethylated during oocyte maturation and embryo development, with exception of blastocyst that was partially methylated. The results found in our study shown several alterations on expression pattern of genes controlled by ICRs 1 and 2. Finally, the data found in our study contributes to the knowledge enrichment concerning bovine oocyte maturations and embryo preimplantation development.