Os receptores de sete domínios de membrana (GPCR) são proteínas que, ao serem ativadas por hormônios, neurotransmissores ou fármacos, disparam vias de sinalização intracelular pela ativação de proteínas G, de quinases e da beta-arrestina. O receptor de angiotensina II do tipo I (AT1R) é um GPCR que representa importante alvo terapêutico para o controle da hipertensão arterial e outras condições de risco cardiovascular. Quando ativado pela angiotensina II (Ang II), produz aumento no tônus arterial, liberação de neurotransmissores e reabsorção renal de sódio para a regulação do meio interno. A O-gluconacilação (O-GlcNAc) é uma modificação pós-traducional que ocorre em proteínas intracelulares, e que está aumentada em distúrbios metabólicos como o diabetes e a hipertensão. Esta modificação ocorre pela anexação enzimática de uma molécula de N-acetil glucosamina endógena a proteínas intracelulares, gerando mudanças na funcionalidade de proteínas responsáveis por regular a fisiologia de vasos sanguíneos e outros órgãos. Considerando estes dois problemas fisiológicos, o objetivo deste trabalho foi investigar, a partir do perfil de sinalização do AT1R em sistemas biológicos com aumento global de proteínas O-gluconaciladas, a hipótese que o aumento de O-GlcNAc altera a sinalização do AT1R, reduzindo o recrutamento de beta-arrestina, e sustentando por mais tempo os efeitos pró-contráteis e deletérios da Ang II. A hipótese foi avaliada por duas frentes de investigação: inicialmente foram cultivadas células HEK293T expressando estavelmente o AT1R humano. As células foram submetidas a aumento global de proteínas O-gluconaciladas usando o inibidor enzimático thiamet G (TMG 1 µM por 16 horas). Em seguida, o AT1R foi ativado por Ang II, agonista endógeno, ou pelo TRV027, agonista tendencioso para a via da beta-arrestina. Foram quantificadas a potência (pEC50) e a eficácia (Rmax) destes agonistas para a fosforilação de quinases, mobilização de cálcio, recrutamento de beta-arrestina e internalização do receptor. Também foi aferida a densidade de AT1R na membrana. Posteriormente foram feitos experimentos usando artérias mesentéricas isoladas de camundongos espontaneamente diabéticos [C57BLKS/6JLepR-/-(+)]; um modelo nativo de expressão de AT1R e de aumento de proteínas O-gluconaciladas, para se relacionar os achados em células com a disfunção vascular associada ao diabetes. Nestas artérias, o AT1R também foi ativado por Ang II e TRV027 e se mediu, além da pEC50 e Rmax de contração, a taxa de taquifilaxia, o recrutamento de beta-arrestina e o tempo de dessensibilização. Nestas artérias isoladas, foram empregados inibidores das quinases PKC (proteína quinase C, RO 31-8220, 1 µM) e MEK [que induz fosforilação e ativação de ERK 1/2 (quinase regulada por sinal extracelular), PD98059, 10 µM], e o quelante de cálcio citoplasmático BAPTA-AM (10 µM). Nas células HEK293T tratadas com TMG houve aumento persistente de proteínas modificadas por O-GlcNAc e, ao se ativar o AT1R, houve aumento na fosforilação de ERK1/2 e dos transientes de cálcio pelo aumento de O-Gluconacilação. Não houve diferença na densidade ou na taxa de internalização do AT1R, nem no recrutamento de beta-arrestina ou ativação de PKC por ação do TMG. Nos experimentos funcionais em artérias isoladas, a resposta contrátil para Ang II foi maior nos animais db/db, comparando-se às artérias dos camundongos heterozigotos db/+. O estímulo para recrutar beta-arrestina (TRV027) reduziu de maneira igual a eficácia da Ang II em artérias dos dois fenótipos de camundongos. A perda de resposta por taquifilaxia foi igual para artérias dos dois animais. A taxa de dessensibilização do AT1R foi maior nas artérias de db/db se comparadas àquela em artérias de db/+. Um outro conjunto de experimentos usando inibidores de quinases foi conduzido para se aferir a participação da ERK 1/2 e da PKC no aumento de contratilidade. Por último, se investigou a contribuição do cálcio intracelular no aumento de eficácia da Ang II nas artérias mesentéricas usando BAPTA. A contratilidade vascular em animais db/db desta vez foi menor que nas preparações não tratadas. Tendo em mãos estes dados, conclui-se que o aumento da eficácia da Ang II diante de elevado conteúdo de O-GlcNAc intracelular ocorre em razão de uma maior biodisponibilidade de íons cálcio como mensageiro secundário e não por uma atuação reduzida da beta-arrestina sobre o receptor.

The seven transmembrane-domain receptors are a superfamily of proteins activated by hormones, neurotransmitters and drugs, triggering intracellular pathways through G proteins, kinases and beta-arrestin activation. The type-I angiotensin II receptor (AT1R) is a target for hypertension therapy and other cardiovascular diseases. AT1R blockade attenuates angiotensin II (Ang II) effects on arterial tone, neurotransmitter release and renal sodium reabsorption. O-GlcNAcylation (O-glcNAc) is a post-translational modification in intracellular proteins, and it is augmented in metabolic disorders such as diabetes and hypertension. O-GlcNAc occurs through enzymatic attachment of an endogenous N-acetyl glucosamine moiety in lateral chains of intracellular proteins, generating changes in vascular function and in the function of other organs. Considering these two physiological problems, the aim of this work was to investigate whether high levels of O-GlcNAcylated proteins alters the signaling triggered by AT1R. We tested the hypothesis that increased O-GlcNAc changes-AT1R signaling, reducing the recruitment of beta-arrestin, sustaining pro-contractile stimuli, and hence increasing deleterious vascular effects of Ang II. Experimental procedures were designed into two ways: initially HEK293T cells stably expressing AT1R were cultured and submitted to a global increase of O-GlcNAcylated proteins using the enzymatic inhibitor Thiamet G (TMG 1 µM for 16 hours). Then, the AT1R was activated by the endogenous agonist Ang II, or TRV027, a biased agonist for the beta-arrestin pathway. Potency (pEC50) and efficacy values (Rmax) were determined for kinase phosphorylation, calcium mobilization, beta-arrestin recruitment and receptor internalization. The density of AT1R on the cell membrane was also measured. Subsequently, experiments were performed using mesenteric arteries isolated from spontaneously diabetic mice [C57BLKS/6JLepR-/-(+)], a native model of AT1R expression and increased O-GlcNAc-modified proteins, as a tentative to correlate cell findings with diabetesassociated vascular dysfunction. In an isolated organ bath chamber, mesenteric arteries were stimulated with Ang II or TRV027, in cumulative contractile-response curves to evaluate pEC50, Rmax. Tachyphylaxis, beta-arrestin recruitment and desensitization. In another set of experiments Kinase inhibitors RO 31-8220 (1 µM; PKC - protein kinase C inhibitor) or PD98059 [(10 µM; MEK inhibitor (phosphorylation of ERK 1/2 extracellular-regulated kinase)] - and the cytoplasmic calcium chelator BAPTA-AM (10 µM) were administrated in situ. HEK293T cells treated with TMG showed a persistent increase in proteins modified by O-GlcNAc. Activation of the AT1R in cells with high O-GlcNAc protein levels induced a greater increase in ERK1/2 phosphorylation and in calcium transients in comparison to control cells. The rate of AT1R internalization, beta-arrestin recruitment or PKC activation remained unmodified after TMG treatment. In the functional experiments, the contractile response to Ang II was increased in db/db arteries compared to arteries from control db/+ heterozygous mice. The biased stimulus for beta-arrestin activation (TRV027) similarly reduced the efficacy of Ang II contraction in both phenotypes equally. Tachyphylaxis-related responses were similar in arteries for both animals. The AT1R desensitization rate was higher in db/db arteries compared to db/+ arteries. Another set of experiments using kinase inhibitors was conducted to assess the role of ERK 1/2, PKC and calcium stored in vascular contractility and finally, the contribution of intracellular calcium to the increased efficacy of Ang II in these arteries was investigated using BAPTA, a cell-permeant calcium chelator. and it was observed that contractility of the db/db mesenteric arteries was decreased by BAPTA, but not by the PKC and MEK inhibitors. We concluded that the increased response to Ang II in cells with high intracellular O-GlcNAc content is a result of greater bioavailability of calcium ions as a secondary messenger and not due to reduced action of beta-arrestin under AT1R activation.