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Mémoire de Maîtrise
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2022.tde-08082022-091553
Document
Auteur
Nom complet
Victor Ferreira Costa
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2022
Directeur
Jury
Cunha, Fernando de Queiroz (Président)
Machado, Cleni Mara Marzocchi
Viola, Patricia Torres Bozza
Titre en portugais
Expressão de desoxirribonucleases endógenas envolvidas na degradação das armadilhas extracelulares de neutrófilos em camundongos com sepse experimental
Mots-clés en portugais
Armadilhas extracelulares de neutrófilos
DNases
NETs
Sepse
Resumé en portugais
Introdução: A sepse é uma condição clínica, caracterizada como disfunção inflamatória sistêmica em resposta a uma infecção, que pode levar a morte. As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas com formato de redes e compostas por proteínas de neutrófilos sobre um arcabouço de DNA. A depuração das NETs é mediada por desoxirribonucleases (DNases), que degradam esse arcabouço. Estudos realizados por nosso grupo de pesquisa demostram um aumento da concentração de NETs no plasma de pacientes com sepse. Além disso, diversos trabalhos mostram que a degradação de NETs por DNases recombinantes melhoram o desfecho de animais com sepse. Objetivo: Analisar a modulação da atividade DNase e a expressão dessas enzimas em animais saudáveis ou com modelo de sepse experimental. Metodologia: Utilizando o modelo de ligadura e punção do ceco (CLP) analisamos a mortalidade causada pelo modelo e os níveis de citocinas no plasma dos animais, além dos níveis de NETs e a atividade DNase no baço, fígado, circulação sistêmica e no lavado peritoneal. Também no baço, fígado, e no lavado peritoneal foi analisado a expressão dos genes para as DNases 1, X e γ. Além disso, verificamos em cultivo de células aderentes do baço se as NETs isoladas e o LPS podem interferir na liberação de DNases. Adicionalmente, utilizando o modelo de sepse induzida por injeção de LPS, verificamos a influência desta toxina na atividade e expressão de DNases no lavado peritoneal. Resultados: O modelo de sepse por CLP proporcionou a mortalidade de 100% dos animais em até 48h após o procedimento, também houve aumento dos níveis das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-6 no plasma desses animais. Os níveis de NETs foram aumentados na circulação, baço, fígado e no lavado peritoneal dos animais com sepse. A atividade DNase dos animais com sepse aumentou no lavado e na circulação após o procedimento, enquanto no baço e fígado permaneceu estável. No baço, foi observado redução da expressão de todas as DNases analisadas, em contrapartida no fígado ocorreu aumento da expressão da DNase 1 e γ, no lavado peritoneal foi observado redução da expressão da DNase γ. Além disso, ambos os estímulos (LPS e NETs) diminuíram a secreção dessas enzimas em células aderentes do baço. Dessa forma, hipotetizamos que o aumento da atividade DNase observado no lavado dos animais sépticos induzidos por CLP, não correspondem as DNases endógenas. Então foi analisado através do modelo com injeção intraperitoneal de LPS, um aumento da atividade da DNase apenas no tempo de 12h após a sepse. Além disso neste modelo, a DNase 1 apresentou aumento de expressão em 12 horas e a DNase γ teve um aumento de expressão em 6 horas seguida por diminuição nos tempos posteriores. Conclusões: Nossos resultados mostram que em animais que passaram pela indução de sepse por CLP há um aumento da atividade Dnase no local da infecção, esse aumento parece ser dependente da presença de bactérias. Além disso, demonstramos que durante a sepse há modulação da expressão de DNases, que parece ser mediada pelo LPS.
Titre en anglais
Expression of endogenous deoxyribonucleases involved on neutrophil extracellular traps degradation in septic mice
Mots-clés en anglais
DNases
NETs
Neutrophil extracellular traps
Sepsis
Resumé en anglais
Introduction: Sepsis is characterized as life-threatening inflammatory dysfunction in response to an infection, which can lead to death. Extracellular neutrophil traps (NETs) are net-like structures composed of neutrophil proteins on a DNA scaffold. The clearance of NETs is mediated by deoxyribonucleases (DNases), which degrade this backbone. Studies carried out by our research group show an increase in the concentration of NETs in the plasma of patients with sepsis. In addition, several studies show that the degradation of NETs by recombinant DNases improves the outcome of animals with sepsis. Objective: Analyze the modulation of DNase activity and the expression of these enzymes in healthy or in an experimental sepsis model animals. Methodology: Using the cecum ligation and puncture (CLP) model, we analyzed the mortality caused by sepsis and the levels of cytokines in the plasma of the animals. Also, we evaluated NETs levels and DNase activity in spleen, liver, systemic circulation and peritoneal cavity. In addition, we analyzed the expression of DNases 1, X and γ genes in spleen, liver, and peritoneal lavage. Furthermore, we verified whether NETs and LPS can interfere with the release of DNases by adherent spleen cells. Using the LPS-induced sepsis model, we verified whether this substance can influence the activity and expression of DNases in peritoneal cavity. Results: The CLP model of sepsis provided the mortality of 100% of the animals within 48 hours after the procedure and increased the levels of cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6 in the plasma of CLP animals. NETs levels were increased in the circulation, spleen, liver and peritoneal lavage of animals with sepsis. The DNase activity of the animals with sepsis increased in the lavage and in the circulation after the procedure, while in the spleen and liver did not show any difference. In the spleen, a reduction in the expression of all DNases analyzed was observed, in contrast, in the liver, there was an increase in the expression of DNase 1 and γ, in the peritoneal lavage, a reduction in the expression of DNase γ was observed. We observed that both stimuli (LPS and NETs) decrease the secretion of these enzymes by these cells. These results led us to the hypothesis that the increase in DNase activity observed in the washing of septic animals induced by CLP does not correspond to endogenous DNases. Thus, it was analyzed that in the endotoxin model, through the intraperitoneal injection of LPS, there was an increase in DNase activity only at the time of 12 h after sepsis. It was also possible to observe a different pattern of DNase expression in this model, DNase 1 showed an increase in expression at 12 hours and DNase γ had an increase in expression at 6 hours followed by a decrease. Conclusions: Our results show that in animals that underwent sepsis induction by CLP there is an increase in Dnase activity at the site of infection, this increase seems to be dependent on the presence of bacteria. Furthermore, we demonstrated that during sepsis there is modulation of DNase expression, which seems to be mediated by LPS.
 
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Date de Publication
2022-08-15
 
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