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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2020.tde-05062020-084655
Document
Auteur
Nom complet
Rafael Sobrano Fais
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2020
Directeur
Jury
Carneiro, Fernando Silva (Président)
Antunes, Edson
Lacchini, Riccardo
Rossoni, Luciana Venturini
Titre en portugais
Papel do NLRP3 na disfunção erétil em modelo de hipertensão DOCA/sal e sua possível ativação por ET-1
Mots-clés en portugais
Disfunção erétil
Endotelina-1
Hipertensão DOCA/sal
NLRP3
Resumé en portugais
Introdução: A disfunção erétil (DE) é definida como a incapacidade de alcançar ou manter a ereção do pênis para um desempenho sexual satisfatório. A DE está, frequentemente, associada a fatores de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares como hipertensão arterial, e/ou doenças metabólicas como dislipidemia e diabetes. A hipertensão arterial tem se tornado um problema crescente de saúde pública, pois é importante fator de risco para o aparecimento de doenças cardiovasculares, cerebrovasculares e renais. Além disso, a DE ocorre com o dobro da frequência em pacientes com hipertensão arterial em relação a pacientes normotensos. Os danos vasculares na hipertensão arterial ocorrem, em parte, devido ao aumento de mediadores inflamatórios. Similarmente, diversos estudos mostram que o aumento da expressão de mediadores inflamatórios está intimamente ligado ao desenvolvimento de DE. A DE é fortemente influenciada pelo aumento da expressão de endotelina-1 (ET-1) em modelo de hipertensão DOCA/sal, devido a seus efeitos contráteis e pró-inflamatórios. O receptor NLRP3 é o membro mais estudado da família do inflamassoma, um complexo multiprotéico do sistema imune inato que desencadeia ativação de caspase-1 e maturação de citocinas pró-inflamatórias, tais como a interleucina-1 beta (IL-1β). O aumento da atividade do receptor NLRP3 promove alterações vasculares, hipertrofia cardíaca e renal, além de aumento na pressão arterial. No entanto, ainda é desconhecido se o NLRP3 contribui para a ação pró-inflamatória da ET-1. Hipótese: O NLRP3 medeia efeitos pró-inflamatórios crônicos da ET-1 no CC de animais DOCA/sal, constituindo-se mecanismo importante para a gênese da DE. Objetivo: Investigar o papel do NLRP3 na liberação de citocinas pró-inflamatórias e recrutamento de células do sistema imune, induzido pela ET-1 e na DE associada ao modelo de hipertensão DOCA/sal. Métodos: Camundongos C57BL/6 (WT) e deficientes para NLRP3 (NLRP3-/-) foram uninefrectomizados e receberam um pellet de silicone contendo desoxicorticosterona acetato (DOCA, 2,4mg/Kg/dia) ou vazio por 21 dias. Estes animais WT foram tratados com bosentan (gavagem 30 mg/Kg/dia) nos últimos 10 dias. Foi verificada a pressão arterial sistólica por pletismografia de cauda destes camundongos antes e nos dias 3, 7, 10, 14 e 21 após a cirurgia. Os níveis de ET-1 foram avaliados no soro, ao passo que os de IL- 1β, TNF-α e IL-6 foram dosados no corpo cavernoso (CC). Avaliamos também a atividade da caspase-1 por meio da sonda fluorescente FLICA. A expressão da caspase-1, pró-caspase-1, IL-1β e pró-IL-1β foi avaliada por Western blotting. A função erétil foi determinada ao estimular eletricamente o nervo cavernoso nas frequências de 0,2 a 20 Hz. A razão entre a média do platô da pressão intracavernosa e a pressão arterial média (PIC/PAM) foi obtida e analisada. A PIC/PAM também foi realizada em resposta a injeção de ET-1 (0,2492 µg/Kg) no CC de camundongos WT com administração prévia de MCC950 (0,42646 µg/Kg) ou veículo no CC. A reatividade do CC foi avaliada pelo relaxamento mediado por estímulo elétrico, para10 acetilcolina e nitroprussiato de sódio, ao passo que a contração foi induzida por fenilefrina. Avaliamos, por citometria de fluxo, o infiltrado de células do sistema imune no CC (macrófagos, neutrófilos, linfócitos Th1 e Th17). A expressão de ICAM-1, VCAM-1, de CCL2 alpha-actina do músculo liso e deposição de colágeno foi determinada. Por último, camundongos WT ou deficientes para RAG-1 (RAG-1-/-) foram uninefrectomizados e receberam um pellet de silicone contendo DOCA (2,4mg/Kg/dia) ou vazio por 21 dias. Afim de verificar o efeito da depleção de neutrófilos na função erétil, camundongos WT foram tratados com anticorpo para depleção de neutrófilos (BE0075-1, injeção intraperitoneal 200 µg) ou veículo nos dias 12 e 17 após a cirurgia. Foi medida a pressão arterial sistólica por pletismografia de cauda destes animais antes, e nos dias 3, 7, 10, 14 e 21 após a cirurgia. A PIC/PAM também foi registrada nesse grupo de animais. Resultados: Os camundongos submetidos ao modelo de hipertensão DOCA/sal tiveram aumento dos níveis de TNF-α, atividade da caspase-1, expressão da caspase-1 e IL-β no CC. O tratamento com bosentan ou a ausência do NLRP3 reverteu ou preveniu estas alterações. Além disso, o tratamento com bosentan, a inibição farmacológica do NLRP3 ou a ausência do NLRP3 restaurou a função erétil (PIC/PAM) e o relaxamento para acetilcolina e para nitroprussitato de sódio no CC de camundongos DOCA/sal. Houve aumento no recrutamento de neutrófilos e linfócitos Th1 para o CC de camundongos DOCA/sal. No entanto, o tratamento com bosentan ou a ausência do NLRP3 preveniu esse aumento. Ainda, o aumento de VCAM-1, ICAM-1 e CCL2 promovido pela hipertensão DOCA/sal foi prevenido pelo tratamento com bosentan ou a deleção gênica do NLRP3. Adicionalmente, observamos que o tratamento com bosentan ou a ausência do NLRP3 previne o aumento na deposição de colágeno ou a de músculo liso no CC dos camundongos DOCA/sal. Por fim, o tratamento com BE0075-1 restaurou completamente o aumento na pressão arterial, na expressão da IL-1β, PIC/PAM, o relaxamento para acetilcolina e para nitroprussiato de sódio em camundongos DOCA/sal. Por outro lado, a deleção gênica do RAG-1 preveniu completamente o aumento na pressão arterial, na expressão da caspase-1, atenuou o prejuízo na função erétil e restaurou o relaxamento para acetilcolina, mas não para nitroprussiato de sódio. Conclusão: O NLRP3 constitui-se um mecanismo importante para a gênese da DE, por meio do aumento na liberação de citocinas, recrutamento de neutrófilos e linfócitos Th1, promovidos pela ET-1 no CC.
Titre en anglais
Endothelin-1 role in NLRP3 activation in smooth muscle tissue of corpora cavernosa
Mots-clés en anglais
DOCA/salt hypertension
Endothelin-1
Erectile dysfunction
NLRP3
Resumé en anglais
Introduction: Erectile dysfunction (ED) is defined as the inability to achieve or maintain an erection of the penis for satisfactory sexual performance. ED is often associated with risk factors for the development of cardiovascular diseases such as arterial hypertension, and/or metabolic diseases such as dyslipidemia and diabetes. Arterial hypertension has become a growing public health problem, as it is an important risk factor for the onset of cardiovascular, cerebrovascular and renal diseases. In addition, ED occurs twice as often in patients with arterial hypertension as compared to normotensive patients. Vascular damage in hypertension occurs, in part, due to the increase in inflammatory mediators. Similarly, several studies show that increased expression of inflammatory mediators are closely linked to the development of ED. ED is strongly influenced by increased expression of endothelin-1 (ET-1) in a DOCA/salt model of hypertension, due to its contractile and pro-inflammatory effects. The NLRP3 receptor is the most studied member of the family of the inflammasome, a multiprotein complex of the innate immune system that triggers caspase-1 activation and maturation of pro-inflammatory cytokines, such as interleukin-1 beta (IL-1β). The increased activity of the NLRP3 receptor promotes vascular alterations, cardiac and renal hypertrophy, in addition to increased blood pressure. However, it is still unknown whether NLRP3 contributes to the pro-inflammatory action of ET-1. Hypothesis: NLRP3 mediates chronic proinflammatory effects of ET-1 on CC of DOCA/salt animals, constituting an important mechanism for the genesis of ED. Objective: To investigate the role of NLRP3 in ET-1-induced inflammatory process modulation and ED associated with the DOCA/salt hypertension model. Methods: C57BL/6 (WT) and NLRP3 deficient (NLRP3-/-) mice were uninefrectomized and received a silicone pellet containing deoxycorticosterone acetate (DOCA, 2.4 mg/Kg/day) or empty for 21 days. These WT animals were treated with bosentan (gavage 30 mg/Kg/day) in the last 10 days. The mice systolic blood pressure was checked by tail cuff before and on days 3, 7, 10, 14 and 21 after surgery. The levels of ET-1 were assessed in the serum, whereas IL-1β, TNF-α and IL-6 were measured in the corpora cavernosa (CC). We also evaluated caspase-1 activity using the FLICA fluorescent probe. The expression of caspase-1, pro-caspase-1, IL-1β and pro-IL-1β was evaluated by Western blotting. Erectile function was determined by electrically stimulating the cavernous nerve at frequencies from 0.2 to 20 Hz. The ratio between the mean plateau of intracavernous pressure and mean arterial pressure (ICP/MAP) was obtained and analyzed. ICP/MAP was also performed in response to ET-1 injection (0.2492 µg/Kg) in the CC of WT mice with previous administration of MCC950 (0.42646 µg/Kg) or vehicle in the CC. CC reactivity was assessed by relaxation mediated by electrical stimulus, for acetylcholine and sodium nitroprusside, while contraction was induced by phenylephrine. We evaluated, by flow cytometry, the infiltration of immune system cells in the CC12 (macrophages, neutrophils, Th1 and Th17 lymphocytes). The expression of ICAM-1, VCAM-1, of CCL2 smooth muscle alpha-actin and collagen deposition was determined. Finally, WT or RAG-1 deficient mice (RAG-1-/-) were uninefrectomized and received a silicone pellet containing DOCA (2.4 mg/kg/day) or empty for 21 days. In order to verify the effect of neutrophil depletion on erectile function, WT mice were treated with antibody for neutrophil depletion (BE0075-1, 200 µg intraperitoneal injection) or vehicle on days 12 and 17 after surgery. Mice systolic blood pressure was measured by tail cuff before, and on days 3, 7, 10, 14 and 21 after surgery. ICP/MAP was also recorded in this group of animals. Results: DOCA/salt hypertensive mice had increased levels of TNF-α, of caspase-1 activity, expression of caspase-1 and IL-1β in CC. Bosentan treatment or the absence of NLRP3 reversed or prevented these changes. In addition, bosentan treatment, pharmacological inhibition of NLRP3 or the absence of NLRP3 restored erectile function (ICP/MAP), relaxation for acetylcholine and sodium nitroprussitate in the DOCA / salt mice. There was an increase in the recruitment of neutrophils and Th1 lymphocytes to the DOCA/salt mice CC. However, treatment with bosentan or the absence of NLRP3 prevented this increase. In addition, the increment in VCAM-1, ICAM-1 and CCL2 promoted by DOCA/salt hypertension was prevented by treatment with bosentan or the NLRP3 gene deletion. Additionally, we observed that treatment with bosentan or the absence of NLRP3 prevents the in collagen or smooth muscle deposition increment in the DOCA/salt mice. Finally, treatment with BE0075-1 completely restored the increase in blood pressure, IL-1β expression, ICP/MAP, the relaxation for acetylcholine and for sodium nitroprusside in DOCA/salt mice. On the other hand, the RAG-1 gene deletion completely prevented the increase in blood pressure, caspase-1 expression, attenuated the impairment in erectile function and restored relaxation to acetylcholine, but not to sodium nitroprusside. Conclusion: NLRP3 is an important mechanism for the genesis of ED, through increased cytokine release, recruitment of neutrophils and Th1 lymphocytes, promoted by ET-1 in CC.
 
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Date de Publication
2020-07-10
 
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