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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2021.tde-28012022-104158
Document
Author
Full name
Mariane Favero Carraro
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2021
Supervisor
Committee
Sebollela, Adriano Silva (President)
Cordeiro, Yraima Moura Lopes
Cruz, Angela Kaysel
Title in Portuguese
Estudos da seletividade e afinidade da interação de anticorpos de cadeia única NUsc a oligômeros do peptídeo β-amiloide
Keywords in Portuguese
Anticorpos de cadeia única
Doença de Alzheimer
NUsc
Oligômeros β-amiloide
scFv
Abstract in Portuguese
A Doença de Alzheimer (DA) é caracterizada pelo acúmulo de agregados do peptídeo β-amiloide, sendo os oligômeros solúveis as principais espécies responsáveis pela perda sináptica e consequente demência. Os mecanismos moleculares pelos quais os oligômeros solúveis de Aβ (AβOs) exercem sua neurotoxicidade ainda não são completamente conhecidos, e ainda não existem tratamentos eficientes para interromper a perda cognitiva nos portadores da DA. Nesse trabalho, buscamos ampliar o estudo funcional dos anticorpos artificiais de cadeia única denominados NUsc's, desenvolvidos em trabalhos anteriores do nosso grupo e selecionados para reconhecer AβOs, sendo capazes de discriminar as espécies-alvo de monômeros e de agregados insolúveis. Aqui, avaliamos a capacidade de formação de complexo do scFv NUsc1 com os AβOs, em comparação com um scFv controle (contra um alvo não-relacionado a Aβ). Também fomos bem-sucedidos em desenvolver uma estratégia para quantificar a afinidade da ligação de NUsc1 aos AβOs, baseada em Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR). E ainda, fomos capazes de detectar o anticorpo NUsc1 produzido in vivo, através de ELISA com extratos de hipocampo de camundongos. A partir dos resultados promissores com NUsc1, decidimos expandir os estudos bioquímicos para outros anticorpos do conjunto, como o anticorpo NUsc7. Nós testamos a especificidade dos anticorpos NUsc1 e NUsc7 (ligados a fago) contra AβOs, em comparação com outras espécies, como oligômeros e monômeros de lisozima. E realizamos uma mutação sítio-dirigida para eliminar um stop-codon na sequência codificante de NUsc7, a fim de possibilitar a expressão do anticorpo na forma livre. Em conjunto, acreditamos que os dados gerados nesse trabalho contribuirão na determinação do potencial dos NUsc's como ferramenta diagnóstica e terapêutica para a DA.
Title in English
Selectivity and affinity studies of the interaction of NUsc single-chain antibodies to β-amyloid peptide oligomers
Keywords in English
β-amyloid oligomers
Alzheimer's disease
NUsc
scFv
Single chain antibodies
Abstract in English
Alzheimer's Disease (AD) is characterized by the accumulation of β-amyloid peptide aggregates, with soluble oligomers being the main species responsible for synaptic loss and consequent dementia. The molecular mechanisms by which soluble Aβ oligomers (AβOs) exert their neurotoxicity are not fully understood, and there are still no effective treatments to interrupt cognitive loss in AD patients. In this work, we seek to expand the functional study of artificial single-chain antibodies called NUsc's, developed in previous studies by our group and selected to recognize AβOs, being able to discriminate target species of monomers and insoluble aggregates. Here, we evaluate the complexing ability of the NUsc1 scFv with the AβOs, compared to a control scFv (against a non-Aβ-related target). We were also successful in developing a strategy to quantify the affinity of NUsc1 binding to AβOs, based on Surface Plasmonic Resonance (SPR). Furthermore, we were able to detect the NUsc1 antibody produced in vivo, through ELISA with mouse hippocampal extracts. Based on the promising results with NUsc1, we decided to expand the biochemical studies to other antibodies in the set, such as the NUsc7 antibody. We tested the specificity of NUsc1 and NUsc7 (phage-bound) antibodies against AβOs, compared to other species such as lysozyme oligomers and monomers. Moreover, we performed a site-directed mutation to eliminate a stop-codon in the coding sequence of NUsc7, in order to allow the expression of the antibody in free form. We believe that the data generated in this work will contribute to determining the potential of NUsc's as a diagnostic and therapeutic tool for AD.
 
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Publishing Date
2022-02-15
 
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