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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2021.tde-10052021-133340
Documento
Autor
Nombre completo
Lilian Pereira Silva
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2020
Director
Tribunal
Goldman, Gustavo Henrique (Presidente)
Matos, Larissa Fernandes
Rodrigues, Marcio Lourenço
Staats, Charley Christian
Título en portugués
Caracterização dos fatores de transcrição que têm o domínio zíper de leucina básica (bZIP) ATF1 em Aspergillus fumigatus
Palabras clave en portugués
Aspergillus fumigatus
AtfA
AtfB
AtfC
AtfD
Estresse osmótico
Via HOG
Virulência
Resumen en portugués
O fungo Aspergillus fumigatus é um importante patógeno oportunista e alérgeno de mamíferos, causando doenças tais como a aspergilose pulmonar invasiva, doença que acomete, principalmente pacientes imunocomprometidos ou sob tratamentos quimioterápicos. A. fumigatus possui uma grande capacidade de adaptação frente a diferentes condições de estresse, sendo capaz de modular a sua maquinaria bioquímica de forma rápida e robusta, garantindo assim a sua sobrevivência. A via de glicerol de alta osmolaridade (HOG) está envolvida nesses processos de adaptação. As quinases MpkC e SakA de A. fumigatus, ortólogas da Saccharomyces cerevisiae Hog1p, constituem o regulador primário da resposta ao estresse hiperosmótico ativados pela via de HOG, um dos sistemas responsáveis pela modulação bioquímica e transcricional frente a diferentes condições de estresse. A resposta transcricional ao estresse osmótico, avaliada por RNAseq, foi comparada entre o tipo selvagem e os mutantes ΔmpkC, ΔsakA e ΔmpkC ΔsakA. Os resultados indicam que MpkC e SakA têm funções independentes e colaborativas durante a resposta transcricional ao estresse osmótico transiente. Foram também caracterizados os mutantes nulos de A. fumigatus para quatro fatores de transcrição com o domínio do tipo zíper de leucina básica (bZip), durante a adaptação a diferentes condições de estresse. Ao longo do estudo, observou-se que os TFs estão envolvidos na capacidade de A. fumigatus se adaptar a diferentes agentes estressores que causam danos à parede celular (tais como Congo Red, CR e Calcofluor White, CFW) e estresse oxidativo (p.ex., peróxido de hidrogênio). Primeiramente, nós investigamos as interações, interações genéticas entre ΔatfA, ΔatfB, ΔatfC e ΔatfD. Os nossos resultados indicam que existem diversos níveis de interações genéticas entre estes mutantes. Entretanto, as mutações ΔatfA e ΔatfB mostram epistasia na maior parte das condições aqui investigadas. Todos os duplos mutantes têm crescimento reduzido na presença de acetato, glicerol e etanol como fontes únicas de carbono, e afetaram o acúmulo de glicogênio e trealose no micélio. Além disso, foi demonstrado através de miscroscopia de fluorescência, que a proteína AtfA:GFP é constitutivamente localizada no núcleo. AtfB, -C e D:GFP foram localizadas constitutivamente apenas 20% no núcleo, aumentando a sua translocação para o núcleo entre 30 and 70 % na presença de condições de estresse. Foi também observado, através de experimentos de co-imunoprecipitação (Co-IP), a interação de AtfA-D com SakA. Também ocorre a formação de heterodímeros entre AtfA-D na presença e ausência de estresses osmótico e de parede celular. Esses dados apontam a importância de AtfA-D e ainda sugerem que esses TFs estão envolvidos não somente na resposta ao estresse, mas também em processos metabólicos de A. fumigatus.
Título en inglés
Characterization of transcription factors containing the basic leucine zipper (bZIP) ATF1 domain in Aspergillus fumigatus
Palabras clave en inglés
Aspergillus fumigatus
AtfA
AtfB
AtfC
AtfD
Osmotic stress
Via HOG
Virulence
Resumen en inglés
The fungus Aspergillus fumigatus is an important opportunistic pathogen and allergen in mammals, causing diseases such as invasive aspergillosis, which mainly affects immunocompromised patients or those undergoing chemotherapeutic treatment. A. fumigatus has a great adaptation ability when faced with different stressful conditions. The fungus is able to modulate its biochemical machinery in a fast and robust way, thus guaranteeing its survival. The high osmolarity glycerol (HOG) pathway is involved in these adaptation processes. The MpkC and SakA kinases of A. fumigatus, orthologous of Saccharomyces cerevisiae Hog1p, constitute the primary regulator of the response to hyperosmotic stress that is activated by the HOG pathway, one of the pathways responsible for biochemical and transcriptional modulation under stress. After performing RNAseq under osmotic stress, the transcriptional responses of wild type A. fumigatus and the strains ΔmpkC, ΔsakA and ΔmpkC ΔsakA were compared. The results strongly indicate that MpkC and SakA have independent and collaborative roles during the transcriptional response to transient osmotic stress. In addition, null mutants for four transcription factors containing the basic leucine zipper (bZIP) domain were identified and characterized. The involvement of the bZIP transcription factors (TF) AtfA, -B, -C and -D during adaptation to different stressful conditions was assessed. These TFs are involved in the ability of A. fumigatus to adapt to different stressful agents, such as congo red (CR) and calcofluor white (CFW), which damage the cell wall, and they are also involved in the response to oxidative stress caused by hydrogen peroxide. First, we investigate the interactions, genetic interactions between ΔatfA, ΔatfB, ΔatfC and ΔatfD. Our results indicate that there are several levels of genetic interactions between these mutants. However, the ΔatfA and ΔatfB mutations show epistasis in most of the conditions investigated here. All double mutants have reduced growth in the presence of acetate, glycerol and ethanol as the sole sources of carbon, and have affected the accumulation of glycogen and trehalose in the mycelium. In addition, it was demonstrated through fluorescence miscroscopy that the AtfA: GFP protein is constitutively located in the nucleus. AtfB, -C and D: GFP were constitutively located only 20% in the nucleus, increasing their translocation to the nucleus between 30 and 70% in the presence of stress conditions. It was also observed, through co-immunoprecipitation (Co-IP) experiments, the interaction of AtfA-D with SakA. The formation of heterodimers between AtfA-D also occurs in the presence and absence of osmotic and cell wall stresses. These data point to the importance of AtfA-D and also suggest that these TFs are involved not only in the response to stress, but also in metabolic processes of A. fumigatus.
 
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Fecha de Publicación
2021-05-21
 
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