A Doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa que afeta atualmente 55 milhões de pessoas no mundo, sendo a forma mais comum de demência. A DA se caracteriza pela perda sináptica, desencadeada por agregados solúveis do peptídeo β-amiloide. Estes agregados, conhecidos como oligômeros de β-amiloide (AβOs), constituem um dos principais biomarcadores da DA. Outro biomarcador de grande importância na DA são os emaranhados neurofibrilares, formados pela agregação da proteína neuronal associada a microtúbulo Tau que decorre de sua hiperfosforilação aberrante. A despeito da relevância dos AβOs e da Tau na patologia da DA, detalhes bioquímicos acerca das conformações mais neurotóxicas desses biomarcadores ainda é discutida. Revelar esses detalhes é fundamental para o desenvolvimento de estratégias diagnósticas e terapêuticas mais eficientes. Na primeira etapa deste trabalho, investigamos a estabilidade da proteína Tau em extratos de cérebro de diferentes modelos animais por western blot. Nossos dados revelaram que ocorre proteólise parcial da Tau em extratos submetidos a um ciclo de descongelamento, mesmo na presença de inibidores, com potencial relevância na reprodutibilidade de ensaios de dosagem de Tau em modelos animais de neurodegeneração. Em seguida, focamos no isolamento de espécies oligoméricas de Aβ in vitro e obtidas de modelos animais, com subsequente caracterização destas espécies. Para isso, usamos como principal ferramenta um anticorpo conformacional do tipo scFv - NUsc1 - previamente caracterizado por nosso grupo, que apresenta alta seletividade por oligômeros com peso molecular > 50 kDa. Após o isolamento bioquímico, dados de cromatografia de gel-filtração e espectrometria de massas nativa indicaram que as espécies isoladas tem peso molecular estimado entre 100 e 250 kDa. Além disso, demos seguimento a estudos prévios sobre o potencial do anticorpo NUsc1 ligado a fago como ferramenta de detecção de AβOs neurotóxicos em amostras derivadas de tecido. Determinamos que nosso ELISA usando NUsc1 ligado a fago detecta até 1 femtomol de AβOs. O ensaio foi capaz ainda de detectar eficientemente AβOs em homogenatos de diferentes modelos animais de DA. Dados preliminares também indicam que o ensaio é eficaz na detecção de AβOs em líquor de ratos transgênicos. Nossos resultados apontam que NUsc1 é uma excelente ferramenta para o isolamento e, principalmente na detecção de agregados relevantes em diversos modelos animais da doença, possibilitando a caracterização estrutural destas espécies e contribuindo para o desenvolvimento de estratégias diagnósticas mais sensíveis que poderão auxiliar no diagnóstico molecular precoce da DA.

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease currently affecting 55 million people worldwide and is the most common form of dementia. AD is characterized by synaptic loss triggered by β-amyloid peptide soluble aggregates. These aggregates, known as β-amyloid oligomers (AβOs), constitute one of the main biomarkers of AD. Another biomarker of great importance in AD are the neurofibrillary tangles, formed by the aggregation of the microtubuleassociated protein Tau, resulting from its aberrant hyperphosphorylation. Despite AβOs and Tau's relevance in AD pathology, biochemical details about the most neurotoxic conformations of these biomarkers are still being discussed. Unraveling these details is essential for developing more efficient diagnostic and therapeutic strategies. In the first part of this work, we investigated Tau protein stability in brain extracts from different animal models by Western blot. Our data showed partial proteolysis of Tau occurring in extracts subjected to a freezethaw cycle, even in the presence of inhibitors, potentially impacting the reproducibility of Tau assays in animal models of neurodegeneration. Next, we focused on the isolation of in vitro AβO species, and also AβOs obtained from animal models, followed by their subsequent characterization. As the main tool, we used the conformational scFv antibody NUsc1, previously characterized by our group, which presents high selectivity for oligomers with molecular weight > 50 kDa. After biochemical isolation, data from size-exclusion chromatography and native mass spectrometry indicated that isolated species present an apparent molecular weight between 100 and 250 kDa. Furthermore, we followed up on previous studies on the potential of phage-bound NUsc1 (pbNUsc1) antibody as a detection tool for neurotoxic AβOs in tissue-derived samples. We determined that our ELISA using pbNUsc1 detects as low as 1 femtomole of AβOs. The assay efficiently detected AβOs in homogenates from different AD animal models. Preliminary data also indicated the assay detects AβOs in CSF from transgenic rats. In conjunction, our results corroborate NUsc1 as an excellent tool for the isolation and for the detection of relevant aggregates in several AD animal models, enabling the structural characterization of those species and contributing to the development of more sensitive diagnostic strategies that may allow the early molecular diagnosis of AD.