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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2020.tde-07092020-102302
Documento
Autor
Nome completo
Verônica Soares Brauer
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2020
Orientador
Banca examinadora
Almeida, Fausto Bruno dos Reis (Presidente)
Alves, Lysangela Ronalte
Faccioli, Lucia Helena
Silva, Patrícia Alves de Castro
Título em português
Ação imunomoduladora de vesículas extracelulares produzidas por Aspergillus flavus
Palavras-chave em português
Aspergillus flavus
Atividade microbicida
Citocinas
Fagocitose
Galleria mellonella
Macrófagos
Vesículas extracelulares
Resumo em português
Dentre as centenas de espécies fúngicas pertencentes ao gênero Aspergillus, A. flavus vem se destacando devido à sua importância no âmbito da medicina e da agricultura. A. flavus é um fungo saprofítico, de ampla distribuição geográfica que infecta plantas e animais. Grande produtor de aflatoxinas, substâncias naturais com capacidade hepatocarcinogênica, o A. flavus contamina safras, principalmente de grãos, podendo causar grandes prejuízos financeiros à agroindústria, além dos problemas de intoxicação devido à ingestão dos alimentos contaminados. Em humanos, A. flavus é o segundo maior causador de casos de aspergilose, que devido ao seus mecanismos de virulência (enzimas hidrolíticas, metabólitos secundários, pigmentos e crescimento em altas temperaturas), consegue evadir ao sistema imune do hospedeiro, estabelecendo a infecção. Vem sendo descrito que fungos utilizam a compartimentalização dos seus fatores de virulência em estruturas chamadas "vesículas extracelulares" (EVs), com objetivo de secretá-los ao meio extracelular, modulando a interação fungo-hospedeiro. Porém, não existem estudos que demonstrem a produção de EVs por A. flavus. Desta forma, nosso objetivo foi avaliar a produção e caracterização de EVs por A. flavus, analisar se estas estruturas conseguem estimular uma resposta imunológica por macrófagos e avaliar o papel das EVs em modelo de infecção utilizando larvas de Galleria mellonella. Para tanto, macrófagos derivados de medula óssea (BMDMs) foram estimulados com EVs produzidas por A. flavus, e parâmetros como produção de mediadores inflamatórios, fagocitose, atividade microbicida e polarização foram analisados in vitro. Em adição, um modelo de infecção in vivo utilizando larvas de G. mellonella foi realizado a fim de analisar o papel protetor ou não das EVs. Nossos resultados demonstram que A. flavus produz VEs, e estas são capazes de estimular a produção de óxido nítrico (NO) e citocinas como fator de necrose tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-6, IL-1β. Macrófagos estimulados com EVs apresentaram maior atividade fagocítica e microbicida, acompanhada por uma polarização para o perfil M1. Por fim, larvas tratadas com EVs previamente ao desafio com conídios de A. flavus, apresentaram maior sobrevivência e maior atividade microbicida. Concluímos então, que EVs produzidas por A. flavus são estruturas bioativas, com capacidade imunogênica, podendo modular a interação entre o fungo e o hospedeiro, auxiliando no controle e eliminação da infecção, evitando o estabelecimento de quadros de aspergilose.
Título em inglês
Immunomodulatory actions of extracellular vesicles produced by Aspergillus flavus
Palavras-chave em inglês
Aspergillus flavus
Cytokine
Extracellular vesicles
Galleria mellonella
Killing
Macrophage
Phagocytosis
Polarization
Resumo em inglês
Among Among the several hundred fungal species belonging to the Aspergillus genus, the A. flavus have been recognized by its importance on medical and agriculture ambit. The A. flavus is a saprophytic fungus, with wide geographical distribution that infects plants and animals. Major aflatoxin producer, natural substances with hepatocarcinogenic action, A. flavus can contaminate crops, mainly of grains, causing huge economical losses to agroindustry, in addition to intoxication problems caused by ingested contaminated food. In humans, A. flavus is the second most common cause of aspergillosis, since it's several virulence factors (as hydrolytic enzymes, secondary metabolites, pigments, growth at high temperatures) allows the fungus to evade the host immune system, establishing the infection. It has been described that the fungi use the compartmentalization of its virulence factors on structures called by "extracellular vesicles" (EVs), in order to secret them on extracellular space, modulating the fungus-host interaction. But, there is no studies demonstrating the EV production by A. flavus. So, our aim was evaluate the EV production by A. flavus, evaluate if these structures are able to induce an immune response on macrophages and the influence of EVs during A. flavus infection in Galleria mellonella larvae. For that, bone-marrow derived macrophages (BMDMs) were stimulated with A. flavus EVs, and parameters of inflammatory mediators production, phagocytosis, killing, and polarization were analyzed in vitro, and we analyzed the possible EV protector role using G. mellonella in vivo model. Our results demonstrated that A. flavus were able to produce EVs, and these structures were able to stimulate nitric oxide (NO), tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-6, and IL-1β production. Macrophages stimulated with EVs showed higher phagocytic and microbicidal activity followed by M1 polarization than untreated macrophages. Finally, G. mellonella larvae treated with EVs previously A. flavus conidia challenge, demonstrated higher survival rates and higher killing activity than untreated larvae. We concluded that EVs produced by A. flavus are a bioactive structure with immunogenic ability, able to modulates the fungus-host interaction and helping in the control and elimination of fungal infection, avoiding the establishment of aspergillosis.
 
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Data de Publicação
2020-10-19
 
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