As acetilxilano esterases (EC 3.1.1.72) são enzimas acessórias que catalisam ligações ésteres dos grupos acetil presentes na estrutura do xilano acetilado e são classificadas na família dos carboidratos esterases (CEs). O presente trabalho teve como objetivo geral a expressão homóloga, produção, purificação, propriedades funcionais e imobilização da acetilxilano esterase de Aspergillus nidulans (AxeAN). Inicialmente, o vetor pEXPYR foi utilizado para codificar o gene da acetilxilano esterase de A. nidulans (AxeAN), seguido da transformação em A. nidulans A773. Esse sistema de expressão permite a secreção de alta produção de proteínas. Na primeira parte deste trabalho, foi produzido a AxeAN recombinante, o extrato foi concentrado e purificado em uma coluna de troca aniônica (Hiprep Q FF 16/10), seguida por uma coluna de exclusão por tamanho (Superdex 75 10/300 GL). AAxeAN purificada foi evidenciada por SDS-PAGE, no qual foi observada a massa molecular de 33,5 kDa. A análise de sequência, modelagem molecular da AxeAN e a análise filogenética revelaram a presença da tríade catalítica (Ser128, His270 e Asp213) e a presença de 10 folhas β e 10 α-hélices, perfil característico de proteínas pertencentes à família α/β hidrolase. O dicroísmo circular confirmou as análises anteriores, demonstrando que a estrutura da AxeAN é composta por α-hélices e folhas β. A AxeAN purificada apresentou atividade específica de 170 U mg-1 determinada para o substrato p-nitrofenil acetato (pNPA). O efeito do pH e da temperatura foi avaliado, e a enzima demonstrou atividade máxima em pH 7,0 e a 55 ºC. A AxeAN apresentou estabilidade em uma ampla faixa de pH (5,5-9,0), mantendo em média 80% de sua atividade inicial após 24 horas de incubação. Além disso, a termoestabilidade foi observada a 45 e 50 ºC por 18 horas de incubação, mantendo uma atividade residual acima de 70%. O efeito de íons, EDTA e possíveis inibidores (furfural e 5-hidroximetil furfural) também foi analisado. A AxeAN apresentou 100% de atividade relativa na presença de Mn2+, Na+ e K+ em concentrações de 1 mmol. L-1 e 5 mmol. L-1. Não foi observado efeito negativo com o uso de EDTA em sua atividade. Por outro lado, houve um aumento na atividade com furfural e 5-hidroximetil furfural. Os parâmetros cinéticos foram determinados utilizando pNPA como substrato, os valores de KM e Vmáx foram de 0,098 mM e 320,1 U. mg-1, respectivamente. O efeito sinérgico da AxeAN foi avaliado juntamente com uma endo-1,4-βxilanase (MpXyn10) de Malbranchea pulchella, utilizando quatro diferentes xilanos (Birchwood, Beechwood, Oat spelt e Arabinoxilano). Os maiores valores foram observados com xilano Birchwood, em especial na produção de xilobiose (13,44 mg. mL-1) com MpXyn10-AxeAN em comparação com apenas MpXyn10, que apresentou uma produção de 10,93 mg. mL-1 após 24 horas a 50 ºC. Na segunda parte deste trabalho, para a imobilização enzimática foi preparado suportes à base de agarose (Amino-agarose, Glioxil-agarose e IDA-agarose), assim como a síntese de suportes à base de nanopartículas de ferro magnética (NPM) (GA-APTES-Nano e APTES-Nano). Também foram utilizados os suportes comerciais NPM (GA-APTES-Nano(TM) e APTES-Nano(TM) juntamente com o Purolite(TM) um suporte comercial, resultando em um total de oito suportes funcionalizados para a imobilização da AxeAN. Os processos de imobilização foram avaliados, e seis derivados (Amino-agarose, Purolite(TM), GA-APTES-Nano, APTES-Nano, GA-APTES-Nano(TM) e APTES-Nano(TM) foram selecionados para as próximas etapas. Os derivados APTES-Nano e APTES-Nano(TM) apresentaram as melhores termoestabilidade a 60 ºC por até 30 minutos, com 90% de atividade residual, em comparação com a enzima livre, que no mesmo período, apresentou apenas 30% de sua atividade residual. Por fim, o derivado GA-APTES-Nano demonstrou a melhor estabilidade operacional, mantendo 95% de atividade após seis ciclos de reação. Os resultados deste estudo mostram-se promissores para a aplicação da AxeAN em futuras hidrólises de biomassa lignocelulósica, visando a obtenção de xilooligossacarídeos e a aplicação em biorrefinarias.

Acetylxylan esterases (EC 3.1.1.72) are accessory enzymes that catalyze ester bonds of acetyl groups present in the structure of acetylated xylan and are classified in the carbohydrate esterases family (CEs). The general objective of the present work was the homologous expression, production, purification, functional properties, and immobilization of acetylxylan esterase from Aspergillus nidulans (AxeAN). Initially, the pEXPYR vector was used to encode the A. nidulans acetylxylan esterase gene (AxeAN), followed by transformation into A. nidulans A773. This expression system allows the secretion of high protein production. In the first part of this work, recombinant AxeAN was produced, and the extract was concentrated and purified on an anion exchange column (Hiprep Q FF 16/10), followed by a size exclusion column (Superdex 75 10/300 GL). The purified AxeAN was demonstrated by SDS-PAGE, in which a molecular mass of 33.5 kDa was observed. Sequence analysis, molecular modeling of AxeAN, and phylogenetic analysis revealed the presence of the catalytic triad (Ser128, His270 and Asp213) and the presence of 10 β-sheets and 10 α-helices, a characteristic profile of proteins belonging to the α/β hydrolase class. Circular dichroism confirmed previous analyses, demonstrating that the structure of AxeAN is composed of α-helices and β-sheets. Purified AxeAN showed a specific activity of 170 U mg1 determined for the substrate p-nitrophenyl acetate (pNPA). The effect of pH and temperature was evaluated, and the enzyme demonstrated maximum activity at pH 7.0 and at 55 ºC. AxeAN showed stability over a wide pH range (5.5-9.0), maintaining an average of 80% of its initial activity after 24 hours of incubation. Furthermore, thermostability was observed at 45 and 50 ºC for 18 hours of incubation, maintaining a residual activity above 70%. The effect of ions, EDTA, and possible inhibitors (furfural and 5-hydroxymethyl furfural) were also analyzed. AxeAN showed 100% relative activity in the presence of Mn2+, Na+ and K+ at concentrations of 1 mmol. L-1 and 5 mmol. L-1. No negative effect was observed with the use of EDTA on its activity. On the other hand, there was an increase in activity with furfural and 5-hydroxymethyl furfural. The kinetic parameters using pNPA as substrate were determined for KM and Vmáx were 0.098 mM and 320.1 U. mg-1, respectively. The synergistic effect of AxeAN was evaluated together with an endo-1,4-β-xylanase (MpXyn10) from Malbranchea pulchella, using four different xylans (Birchwood, Beechwood, Oat spelt, and Arabinoxylan). The highest values were observed with Birchwood xylan, especially in the production of xylobiose (13.44 mg. mL-1) with MpXyn10-AxeAN compared to just MpXyn10, which presented a production of 10.93 mg. mL-1 after 24 hours at 50 ºC. In the second part of this work, agarose-based supports (Amino-agarose, Glyoxylagarose and IDA-agarose) were prepared for enzymatic immobilization, as well as the synthesis of supports based on magnetic iron nanoparticles (NPM) (GA- APTES-Nano and APTES-Nano). Commercial NPM supports (GA-APTES-Nano(TM) and APTES-Nano(TM) were also used together with Purolite(TM), a commercial support, resulting in a total of eight functionalized supports for AxeAN immobilization. The immobilization processes were evaluated, and six derivatives (Amino-agarose, Purolite(TM), GA-APTES-Nano, APTES-Nano, GA-APTES-Nano(TM) and APTES-Nano(TM) were selected for the next steps. The APTES-Nano and APTES-Nano(TM) derivatives showed the best thermostability at 60 ºC for up to 30 minutes, with 90% residual activity, compared to the free enzyme, which showed only 30% of its residual activity in the same period. Finally, the GA-APTES-Nano derivative demonstrated the best operational stability, maintaining 95% activity after six reaction cycles. The results of this study are promising for the application of AxeAN in future hydrolysis of lignocellulosic biomass, aiming to obtain xylooligosaccharides, and their application in biorefineries.