O interesse global em reduzir os impactos ambientais e econômicos associados ao uso de combustíveis fósseis preconiza novas fontes energéticas, renováveis e de baixo custo. Nesse cenário, o etanol de segunda geração (2G) surge como uma alternativa promissora ao utilizar biomassas lignocelulósicas (BLCs) como fontes de matéria-prima. Entretanto, a desconstrução das BLCs e a fermentação dos açúcares resultantes deste processo, são alguns dos desafios a serem superados para a uma produção economicamente viável do etanol 2G. Fungos lignocelulolíticos, como o Trichoderma reesei são industrialmente explorados devido o seu potencial em produzir e secretar holocelulases (celulases e hemicelulases). Por outro lado, o fungo T. reesei apresenta um sistema de transporte complexo responsável pelo carreamento efetivo dos açúcares, provenientes das BLCs que atuam como moléculas indutoras ou repressoras da biossíntese de holocelulases. Apesar deste fungo ter alcançado um notável interesse na indústria bioenergética, o sistema de transporte de açúcares do T. reesei ainda permanece pouco explorado. Deste modo, uma melhor compreensão dos transportadores de T. reesei pode ser uma estratégia valiosa para projetar melhores linhagens de interesse da indústria 2G e superar os desafios produtivos do bioetanol. Neste estudo, pretendemos lançar luz sobre esse assunto através da caraterização funcional de novos transportadores T. reesei. Inicialmente, análises filogenéticas e ancoragem molecular indicaram o potencial dos novos transportadores de T. reesei em carrear os açúcares constituintes da BLCs (xilose, celobiose, manose e glicose). A validação funcional in vivo dos transportadores foi realizada através da expressão heteróloga das proteínas em plataformas microbianas (Saccharomyces cerevisiae EBY.VW4000 e SC9721) que não apresentam um sistema de transporte funcional para estes açúcares. Desta forma, foi possível caracterizar três transportadores de xilose (Tr54632, Tr68122 e Tr79202) e um transportador (Tr441745) de celo-oligossacarídeos. Além disso, a expressão dos transportadores Tr54632 e Tr79202 suportou um baixo crescimento da levedura EBY.VW4000 em outros açúcares da holocelulose, como glicose e manose, respectivamente. Enquanto, a levedura abrigando Tr44175 foi capaz de captar soforose, fonte de carbono indutora da expressão de hocelulases. Portanto, o presente trabalho abre novos caminhos para a engenharia de cepas com aplicação na indústria bioenergética.

The global interest in reducing the environmental and economic impacts associated with the use of fossil fuels advocates new, renewable, and low-cost energy sources. In this scenario, second-generation ethanol (2G) emerges as a promising alternative when using lignocellulosic biomass (LCB) as feedstock. However, the deconstruction of BLCs and the fermentation of sugars resulting from this process are some of the challenges to be overcome for an economically viable production of 2G ethanol. Lignocellulolytic fungi, such as T. reesei are industrially exploited due to their potential to produce and secrete holocellulases (cellulases and hemicellulases). On the other hand, T. reesei possesses a complex transport system responsible for the effective transport of sugars derived from LCBs, which act as inducers or repressors of holocellulase biosynthesis. Despite the notable interest of this fungus in the bioenergy industry, the sugar transport system of T. reesei remains largely unexplored. Thus, a better understanding of T. reesei transporters can be a valuable strategy to design improved strains of interest to the 2G industry and overcome the production challenges of bioethanol. In this study intends to shed light on this subject through the functional characterization of new T. reesei transporters. Initially, our phylogenetic analyzes and molecular docking indicated the potential of the new T. reesei transporters to carry the essential sugars of holocellulose (xylose, cellobiose, mannose and glucose). The functional validation was carried out through the heterologous expression of the transporters in microbial platforms (EBY.VW4000 and SC9721) that do not present a functional transport system for these sugars. In this way, it was possible to characterize three xylose transporters (Tr54632, Tr68122, and Tr79202) and one cellobio-oligosaccharide transporter (Tr441745). In addition, the expression Tr54632 and Tr79202 transporters supported low growth of the yeast EBY.VW4000 in other holocellulosic sugars, such as glucose and mannose, respectively. Meanwhile, the yeast harboring Tr44175 was able to carry sophorose, a carbon source that induces the expression of hocellulases. The present work characterized transporters for which no transport activity had been previously described; thus, new paths are opened for the strains engineering with applications in the bioenergy industry.