Membranas de placa óssea de rato foram preparadas a partir de implante de pó de osso desmineralizado no tecido subcutâneo de ratos Wistar e purificadas em coluna de Sepharose 4B (Cell. Mol. Biol. 32: 55, 1986). A remoção da fosfatase alcalina das membranas foi feita com fosfolipase C específica para fosfatidilinositol (Biochim. Biophys. Acta 1368: 108, 1998) e a atividade de nucleotídeo fosfatase determinada a 37°C, em tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo MgCl₂2 mM, teofilina 5 mM, em um volume final de 1 mL. Durante o processo de purificação das membranas livres de fosfatase alcalina, a razão entre as velocidades de hidrólise do ATP e do ADP permaneceu constante (da ordem 2,4) sugerindo que elas correspondem a uma mesma enzima. O mesmo perfil de pH foi observado para a hidrólise do ATP e ADP e o pH ótimo aparente é 7,5. Estudos de competição de substratos mostrou que, independentemente da relação entre as concentrações de ATP e ADP presentes no meio reacional, as atividades específicas sempre similares sugerem inequivocamente que a hidrólise do ATP e ADP representam reações competitivas para um único sítio na enzima. Uma significativa inibição da hidrólise do ATP e ADP pela enzima foi observada na presença de azida de sódio, um inibidor de apirases, em concentrações que variaram entre 2,5 mM (ADP) e 7,5 mM (ATP). Os valores dos parâmetros cinéticos calculados para a hidrólise dos diferentes substratos pela enzima mostram que a atividade NTFase é quase duas vezes maior que a correspondente NDFase enquanto a NMFase é nula ou desprezível. A preparação não está contaminada por fosfatases não específicas, ATP-pirofosfatase (EC 3.6.1.8), pirofosfatase inorgânica (EC 3.6.1.1), fosfodiesterases, adenilato quinase e proteína fosfatases. Em condições saturantes de ATP e magnésio, a atividade das membranas livres de fosfatase alcalina não é inibida pela oligomicina, ouabaína, bafilomicina A₁ tapsigargina, omeprazol, ácido etacrínico e AP₅A. Entretanto, a velocidade de hidrólise do ATP e ADP é reduzida cerca de 30% e 40%, respectivamente, na presença de suramina 1 mM, um antagonista do receptor de purina P₂. Na ausência de íons magnésio ou cálcio, a hidrólise do ATP e ADP é desprezível enquanto na presença de íons cálcio ou magnésio a estimulação da atividade da enzima por tais íons é similar e cada íon pode substituir o outro durante o ciclo catalítico da enzima. A hidrólise do ATP e ADP diminuiu consideravelmente na presença de Polidocanol 1%, Lubrol WX 1,35%, Lubrol PX 1%, CHAPS 2,5%, C₁₂E₈ 1%, Triton X-114 1%, Triton X-100 0,2%, n-octil-β-D-glicosídeo 30 mM, polioxietileno-5-decil éter 0,5%. Os resultados mais promissores foram obtidos com a adição conjunta de digitonina e dimiristoil L-α-fosfatidilcolina (DMPC). Dentre todos os detergentes utilizados, a digitonina, na proporção de 5:1 (mg/mL) foi mais eficaz na solubilização. A ATPase existente na membrana de placa óssea de rato e livre de fosfatase alcalina pode ser considerada uma ATP-difosfohidrolase por apresentar especificidade para nucleotídeos di e trifosfatos; não hidrolisar nucleotídeos monofosfato e fosfomonoésteres não nucleotídeos; ser ativada por íons cálcio ou magnésio; não ser inibida pelos inibidores de V-, Ca²⁺-, H⁺-, e Na⁺ ou K⁺-ATPases; ser inibida por altas concentrações de azida de sódio; apresentar a mesma faixa de pH para NTF e NDF; ser facilmente inativada por detergentes; apresentar valores similares de Km (100 µM) para o ATP e ADP.

Rat osseous plate membranes obtained fourteen days after the implantation of demineralized bone particles in the subcutaneous tissue of Wistar rats, were prepared and purified on Sepharose 4B column (Cell. Mol. Biol. 32:55-62). Alkaline phosphatase-free membranes were prepared treating the rat osseous plate membranes with phosphatidylinositol-specific phospholipase C from B. thuringiensis (Biochim. Biophys. Acta 1368: 108, 1998). Nucleotide phosphatase activity was assayed at 37°C, in Hepes buffer 50 mM, pH 7,5, containing MgCl₂ mM and theophylline 5 mM, in a final volume of 1 mL. The ATPase present in the membranes of osseous plate hydrolyzed nucleotide triphosphates (NTP) at a rate 2-fold higher than that of nucleotide diphosphates (NDP). However, the hydrolysis of nucleotide monophosphates was negligible. The apparent optimum pH of hydrolysis for NTP and NDP was 7.5. The enzyme hydrolyzed ATP following Michaelian kinetics, with V= 1,278.7 U/mg e K_m = 83.3 µM. For ADP, it was also observed a single family of hydrolyzing sites (n= 1,0) with V= 473.9 U/mg e K_m= 150.6 µM. In the absence of magnesium ions, the hydrolysis of ATP or ADP was negligible. A systematic study of the stimulation of the enzyme by calcium and magnesium ions suggested that any of these ions can replace the other during the catalytic cycle ofthe enzyme. Theophylline, a phosphodiesterase inhibitor, showed a negligible inhibition of the hydrolysis of ATP and ADP at concentrations up to 7 mM, but sodium azide was a effective inhibitor of ATP (7.5 mM) and ADP (2.5 mM) hydrolysis. On the other hand, the classical V-, P- and F-type ATPase inhibitors had no effect on the hydrolysis of ATP and ADP by the alkaline-free rat osseous plate membranes. A systematic study including a series of other inhibitors excluded the presence of contaminations by non specific phosphatases, inorganic pyrophosphatase, phosphodiesterase and protein phosphatase that could participate on the hydrolysis of NDP and NTP. AP₅A had no effect on the hydrolysis of ATP and ADP by the enzyme, but suramin inhibited 30 and 40% the hydrolysis of ATP and ADP, respectively. The solubilization of the alkaline phosphatase-free rat osseous plate membrane ATPase with detergents commonly used to solubilize membrane proteins resulted in a significant depletion ofthe enzyme activity. The kinetic similarities of the alkaline phosphatase-free rat osseous plate membrane ATPase with respect to the hydrolysis of NTP and NDP suggested that it apparently functions as an ATP-diphosphohydrolase.