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Disertación de Maestría
DOI
10.11606/D.11.2016.tde-31032016-155120
Documento
Autor
Nombre completo
Melina Luz Mary Cruzado Bravo
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Piracicaba, 2015
Director
Tribunal
Sturion, Gilma Lucazechi (Presidente)
Silva, Nathália Cristina Cirone
Nascimento, Maristela da Silva do
Tenório, Clarice Gebara Muraro Serrate Cordeiro
Título en portugués
Estudo genotípico e fenotípico de Staphylococcus spp formadores de biofilme isolados em linhas de produção de queijo Minas Frescal e de leite de vacas com mastite no Estado de São Paulo, Brasil
Palabras clave en portugués
Agar vermelho congo
MEV
MSCRAMM
Superfícies
Resumen en portugués
A formação de biofilmes em superfícies que entram em contato com alimentos pode resultar em contaminação em qualquer parte do processo produtivo, podendo assim, ser causa de doenças transmitidas por alimentos. A formação de biofilmes por Staphylococcus ssp. é uma das grandes preocupações na indústria de lácteos, e também na área da medicina veterinária. A presente pesquisa teve como objetivo avaliar a capacidade de formação de biofilmes de Staphylococcus spp. isolados de laticínios produtores de queijo Minas Frescal e de leite de vacas com mastite subclínica. O estudo foi realizado em 3 fases, sendo a primeira uma caracterização fenotípica de 150 isolados de Staphylococcus spp. pelo teste do Ágar Vermelho Congo (AVC). Na segunda fase, foi realizada uma caracterização genotípica dos isolados de Staphylococcus spp., pesquisando os genes icaA, icaD, bap, bbp, cna, ebpS, eno, fib, fnbA, fnbB, clfA e clfB. Na terceira fase foram selecionadas 10 cepas com diferentes perfis genotípicos e três cepas padrão de Staphylococcus spp., para avaliação da capacidade de formação de biofilmes. Foi avaliada a capacidade de formação de biofilmes das 13 cepas em três tempos (12h, 48h e 96h), duas temperaturas (5°C e 25°C) e duas superfícies de contato (aço inoxidável 304 e polipropileno) tendo como primeira variável resposta a densidade óptica a 600 nm obtida utilizando metodologia do cristal violeta e a segunda variável resposta foi a contagem microbiológica de células viáveis (log10UFC cm-2) aderidas nas superfícies testadas. Foi utilizado um Delineamento Inteiramente Casualizado (DIC) com fatorial de 13x3x2x2. No AVC 38,7% (n=58) dos 150 isolados foram positivos para formação de biofilme. Observou-se que 93,3% (n=140) dos 150 isolados possuíam o gene clfA, 87,3% (n=131) o eno, 62,7% (n=94) o ebpS, 54,7% (n=82) o fib, 54% (n=81) o fnbA, 53,3% (n=80) o icaD, 47,3% (n=71) os genes icaA e clfB, 43,3% (n=65) o fnbB, 17,3% (n=26) o bap, 8% (n=8) o cna e 4% (n=40) o gene bbp. Pelo Teste de Friedman (α=0,05) os fatores cepa, temperatura e superfície foram significativos (p<0,0001) para as duas variáveis resposta na formação de biofilmes, enquanto que, entre os tempos de avaliação não houve diferença significativa (p>0,05). A maior produção de biofilme (avaliada por densidade óptica) foi observada a 25°C no aço inoxidável, sendo que as cepas S. epidermidis ATCC 35984 e S. aureus 119 foram as cepas que apresentaram maior formação de biofilme. Nas superfícies testadas foram observadas contagens microbiológicas na faixa entre 6,5 e 7,6 log10UFC cm-2 que sugerem formação de biofilme. Foram selecionadas 6 cepas para realizar a Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), as quais confirmaram a formação de biofilme em aço inoxidável e polipropileno em 5°C e 25°C sendo avaliadas á 12 e 96 horas.
Título en inglés
Genotypic and phenotypic study of Staphylococcus spp. biofilm formers isolated in Frescal Minas cheese production lines and cows with mastitis in São Paulo, Brazil
Palabras clave en inglés
CRA
MSCRAMM
SEM
Surfaces
Resumen en inglés
The biofilm formation on surfaces, which are contact with food, can result in contamination in any part of the food processing, causing foodborne illness. The biofilm formation by Staphylococcus ssp. is one of the main concern in the dairy industry, and in the veterinary medicine field. This research aimed to evaluate the biofilm formation capacity of Staphylococcus spp., isolated from dairy producers of "Minas Frescal" cheese and cows with subclinical mastitis. The study was conducted in three stages, being the first a phenotypic characterization of 150 Staphylococcus spp. strains using the Congo Red Agar (AVC) test. In the second stage, the genotypic characterization with the screening of the gens icaA, icaD, bap, bbp, cna, ebpS, eno, fib, fnbA, fnbB, cIfA and clfB was performed. In the third stage, 10 strains with different genotypic profiles and 3 standard strains of Staphylococcus spp. were selected to evaluate the biofilm formation capacity. The biofilm formation capacity of 13 strains at three times (12h, 48h and 96h), two temperatures (5 °C and 25 °C) and two contact surfaces (stainless steel 304 and polypropylene) was evaluated. As a result, the optical density at 600 nm obtained by the methodology of crystal violet and the microbiological count of viable cells (log10UFC cm-2) (adhered to the tested surfaces) was analyzed. A completely randomized design was used in a factorial 13x3x2x2. In AVC agar, 38.7% (n = 58) of the 150 isolates were positive for biofilm formation. The 93.3% (n = 140) of the 150 isolates had the cIfA gene, 87.3% (n = 131) the eno, 62.7% (n = 94) the ebpS, 54.7% ( n = 82) fib, 54% (n = 81) the fnbA, 53.3% (n = 80) the icaD, 47.3% (n = 71) icaA and clfB gens, 43.3% (n = 65) the fnbB, 17.3% (n = 26) bap, 8% (n = 8) the cna and 4% (n = 40) bbp gene. The factors strain, temperature and surface were significant (Friedman test p <0.0001) for both response variables in the formation of biofilms, while, time did not have significant difference (p> 0.05). The increased production of biofilm (assessed by optical density) was observed at 25 °C in stainless steel surfaces. The strains S. epidermidis ATCC 35984 and S. aureus 119 were the strains that showed the highest production of biofilm. In the tested surfaces, microbiological counts were observed in the range between 6.5 and 7.6 log10CFU m-2 suggesting biofilm formation. The formation of biofilms in 6 evaluated strains has been confirmed by Scanning Electron Microscopy (SEM) on stainless steel and polypropylene on 5°C and 25°C with 12 and 96 h of incubation.
 
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Fecha de Publicación
2016-04-11
 
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