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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.11.2013.tde-29082013-095902
Documento
Autor
Nome completo
José de Oliveira Carvalho Neto
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 2013
Orientador
Banca examinadora
Sartori Filho, Roberto (Presidente)
Alvarenga, Fernanda da Cruz Landim e
Buratini Júnior, José
Dell'Aqua Junior, José Antonio
Dode, Margot Alves Nunes
Título em português
Aspectos moleculares, estruturais e funcionais de espermatozoides bovinos sexados por citometria de fluxo
Palavras-chave em português
Biotecnologia
Bovinos
Fecundação
Reprodução
Resumo em português
A sexagem espermática tem um grande impacto na produção animal, pois permite a escolha do sexo dos descendentes, tendo o seu uso aumentado consideravelmente nos últimos anos. Atualmente, as taxas de blastocistos produzidos in vitro com sêmen sexado são semelhantes às com sêmen não sexado. Entretanto, quando utilizado na inseminação artificial (IA) e/ou transferência de embriões (TE) as taxas de gestação ou produção de embriões ainda são inferiores às obtidas com sêmen convencional. Esses resultados indicam que são necessários mais esclarecimentos sobre o efeito da sexagem nas células espermáticas. Este estudo teve o objetivo de avaliar possíveis alterações moleculares e funcionais dos espermatozoides causadas pelo processo de sexagem, além de tentar identificar diferenças entre espermatozoides contendo o cromossomo X ou Y. Para isto, um ejaculado de cada touro Nelore (n=4) foi colhido e separado em três frações: não sexado (NS), sexado X (SX) e sexado Y (SY), sendo utilizado em 3 experimentos. Nos experimentos 2 e 3, um quarto grupo foi formado pelo pool de espermatozoides sexados X e Y (XY). No primeiro experimento, utilizando a técnica de bisulfito de sódio, foi realizada a avaliação do padrão de metilação dos genes imprinted IGF2 e IGF2R em espermatozoides sexados e não sexados. No segundo experimento, foi avaliado o efeito da sexagem no tamanho e na forma da cabeça do espermatozoide e as possíveis diferença entre espermatozoides contendo cromossomo X ou Y. No último experimento, verificou-se o efeito da sexagem espermática na longevidade dos espermatozoides mantidos em meio de cultivo por 12 horas e na sua capacidade de se ligar às células da tuba uterina (CTU). No experimento relacionado à epigenética, não foi encontrada diferença no padrão de metilação dos genes IGF2 e IGF2R. Entretanto, identificou-se um polimorfismo no gene IGF2, e um padrão de metilação específico do gene IGF2R, provavelmente devido a uma característica epigenética especifica de animais Bos indicus. No experimento 2, não foi encontrada diferença em nenhuma das 23 variáveis estudadas entre os grupo X e Y. Entretanto, usando simultaneamente diversos parâmetros por meio de análise discriminante, na tentativa de diferenciar os grupos, o modelo mais discriminante atingiu 100% de precisão na identificação de espermatozoides de cada grupo NS, SX, SY e SXY. No experimento 3 foi identificado que o processo de sexagem afeta características estruturais da célula espermática, induzindo umacapacitação e reação acrossômica. Porém, ao longo de 12 horas de cultivo, a cinética dos espermatozoides sexados foi semelhante a do sêmen convencional. Além disto, foi identificado que o processo de sexagem comprometeu a capacidade dos espermatozoides de se manterem ligados às CTU. Em relação aos espermatozoides X e Y, foi observada uma menor capacidade do grupo X de se ligar às CTU, assim como uma diferença em características relacionadas à motilidade e acrossoma. Esses resultados podem contribuir no estabelecimento de procedimentos mais adequados para melhorar o aproveitamento e os resultados quando da utilização do sêmen sexado e em melhorias no processo de sexagem, ou mesmo no desenvolvimento de novas tecnologias para a separação de espermatozoides X ou Y.
Título em inglês
Molecular, structural and functional characteristics of the bovine sperm sexed by flow citometry
Palavras-chave em inglês
Biotechnology
Bovine
Fertilization
Reproduction
Resumo em inglês
Sperm sorting can have a great impact on breeding programs because it allows sex selection of the offspring, being its use increased considerably in last few years. Currently the rate of in vitro produced blastocyst using sexed sperm is similar to that obtained with no sexed sperm. However, lower rates of pregnancy and blastocyst are observed when sexed sperm are used for artificial insemination or embryo transfer compared to the conventional sperm. These results suggest that further studies are needed to clarify the effects of sexing process on sperm cells. This study aimed to evaluate molecular and functional changes caused by the sorting process, as well as to identify possible differences between sperm containing the X or Y chromosome. Each ejaculate of Nelore bulls (n=4) was collected and separated into three fractions: non-sexed (NS), sexed for X-sperm (SX), and sexed for Y-sperm (SY), being used in 3 experiments. For the experiment 2 and 3 a fourth group was formed by pooling SX and SY samples (SXY). On the first experiment, methylation pattern of the IGF2 and IGF2R imprinted gene in sexed and non sexed sperm was assessed using sodium bisulfite method. On the experiment 2, we evaluated whether sexing by flow cytometry changes the shape and size of the sperm head, and if these measurements differ between cells that bearing the X or Y chromosome. In the last experiment, the effect of sorting process on sperm longevity during 12 h incubation and their ability to bind to oviduct cells were evaluated. In the experiment related to methylation patterns, sex-sorting procedures have not affected DNA methylation patterns of the IGF2 and IGF2R genes. However, a polymorphism was found in IGF2 gene, and a very specific methylation patterns was observed in the IGF2R gene, probably due to an epigenetic characteristic in Bos indicus cattle. On experiment 2, no differences between X and Y sperm group were observed for any of the studied characteristics. However, using different parameters simultaneously in discriminator analysis, in an attempt to differentiate groups, the greatest discriminator model had 100% accuracy to identify the sperm from NS, SX, SY and SXY group. On experiment 3, it was identified that sorting process affected structural sperm characteristics, inducing a pre capacitation status and acrosome reaction. However, after 12 hours of incubation the kinetics of the sexed sperm was similar to the non sexed sperm. Furthermore, sexing process affected the ability of sperm to maintained bound to the oviduct cells. Regarding X and Y sperm, it was observed that X group had a lower ability to bind to the CTU, being the X sperm more susceptible to sorting process than the Y sperm. These results can contribute to improve the use and results of the sexed sperm, as well as to induce enhancements in the sexing process, or even to develop new technologies for separation of X or Y sperm cell.
 
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Data de Publicação
2013-09-18
 
AVISO: O material descrito abaixo refere-se a trabalhos decorrentes desta tese ou dissertação. O conteúdo desses trabalhos é de inteira responsabilidade do autor da tese ou dissertação.
  • CARVALHO, J. O., et al. Cinética de espermatozoides criopreservados de bovinos após sexagem por citometria de fluxo. Pesquisa Agropecuária Brasileira (1977. Impressa), 2009, vol. 44, p. 1346-1351.
  • CARVALHO, J. O., et al. Nanoscale Differences in the Shape and Size of X and Y Chromosome-Bearing Bovine Sperm Heads Assessed by Atomic Force Microscopy [doi:10.1371/journal.pone.0059387]. Plos One [online], 2013, vol. 8, p. e59387.
  • Carvalho, J.O., et al. Quality assessment of bovine cryopreserved sperm after sexing by flow cytometry and their use in in vitro embryo production [doi:10.1016/j.theriogenology.2010.06.030]. Theriogenology [online], 2010, p. 1521-1530.
  • Carvalho, José O., et al. The methylation patterns of the IGF2 and IGF2R genes in bovine spermatozoa are not affected by flow-cytometric sex sorting [doi:10.1002/mrd.21410]. Molecular Reproduction and Development [online], 2012, vol. 1, p. n/a-n/a.
  • Machado, G.M., et al. Morphology, sex ratio and gene expression of Day 14 in vivo and in vitro bovine embryos [doi:10.1071/rd11282]. Reproduction, Fertility and Development [online], 2013, vol. 25, p. 600-608.
  • CARVALHO, J. O., et al. 278 METHYLATION STATUS IN THE INTRAGENIC DIFFERENTIALLY METHYLATED REGION OF THE IGF2 LOCUS IN UNSORTED AND SEX-SORTED SPERM [doi:10.1071/RDv23n1Ab278]. In 37th Annual Conference of the IETS, Orlando, 2011. Reproduction, Fertility and Development., 2011. Abstract.
  • CARVALHO, J. O., et al. Quality assessment of bovine cryopreserved sperm after sexing by flow cytometry and its use for in vitro embryo production. In IETS, Córdoba, 2010. Reproduction, fertility and development. : CSIRO, 2010. Abstract. Available from: http://www.publish.csiro.au/paper/RDv22n1Ab365.htm.
  • CARVALHO, J. O., et al. Sexagem por citometria de fluxo não afeta o padrão de metilação dos genes IGF2 e IGF2r de espermatozóide bovino. In XXV Reunião Annual da SBTE, Cumbuco, 2011. Anais da XXV Reunião Annual da SBTE., 2011. Resumo.
  • CARVALHO, J. O., et al. Sexing by flow cytometry changes morphometric characteristics and surface membrane of bovine spermatozoa. In XXIV Reunião Anual da SBTE, Porto de Galinhas, 2010. Acta Scientiae Veterinariae., 2010. Abstract.
  • Carvalho, J.O., et al. Flow-cytometry sex sorting does not affect the methylation pattern of the IGF2 gene in the bovine embryo. In 26th Annual Meeting of the Brazili an Embryo Technology Society (SBTE), Foz do Iguaçu, 2012. Animal Reproduction., 2012. Abstract.
  • LEMES, A. P., et al. Effect of Hoechst 33342 in the kinetics of bovine sperm cells analysed by computer system (CASA). In XXIV Reunião Anual da SBTE, Porto de Galinhas, 2010. Acta Scientiae Veterinariae ., 2010. Abstract.
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