Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.11.2004.tde-21092004-150138
Documento
Autor
Nome completo
Denise Santos da Silva
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 2004
Orientador
Banca examinadora
Lambais, Marcio Rodrigues (Presidente)
Carrer, Helaine
Fiore, Marli de Fatima
Novello, Jose Camillo
Wulff, Nelson Arno
Título em português
Análise dos proteomas extracelulares e do acúmulo de moléculas sinais durante o crescimento da Xylella fastidiosa 9a5c in vitro.
Palavras-chave em português
bacterias fitopatogênicas
clorose variegada dos citros
crescimento in vitro
eletroforese em gel
insetos vetores
proteínas
Resumo em português
A bactéria Xylella fastidiosa 9a5c é o agente causal da clorose
variegada dos citros (CVC) e responsável por grandes perdas econômicas na
citricultura. O genoma de X. fastidiosa 9a5c foi totalmente seqüenciado e a sua
análise permitiu identificar vários genes possivelmente envolvidos na
patogenicidade/virulência da bactéria. Como os sintomas da CVC desenvolvemse
um longo tempo após a infecção da planta pela bactéria e a severidade da
doença têm sido associada à altas temperaturas, é possível que a expressão de
fatores de patogenicidade/virulência seja dependente de densidade celular e/ou
estresses térmicos. Desta forma, o crescimento in vitro da X. fastidiosa foi
monitorado através da absorbância de suspensões bacterianas à 600nm (A600),
número de unidades formadoras de colônias (UFC) e viabilidade celular,
durante 16 dias de cultivo em meio PW modificado líquido, à 28 e 32ºC.
Proteínas extracelulares foram extraídas e analisadas através da eletroforese
bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE). Bioensaios foram utilizados
para verificar a produção de moléculas sinais por X. fastidiosa. Os resultados
obtidos mostraram que o crescimento de X. fastidiosa à 32ºC, com base na
A600, não diferiu do crescimento à 28ºC. No entanto, com base no número de UFCs e viabilidade celular, o crescimento de X. fastidiosa diferiu em função da
temperatura, tempos de incubação e a interação entre esses fatores.
X. fastidiosa produziu maior número de proteínas extracelulares à 32 do que à
28ºC, mostrando que a secreção de proteínas em X. fastidiosa é regulada pela
temperatura de incubação. Várias proteínas extracelulares produzidas por
X. fastidiosa à 28 e 32ºC são moduladas durante o crescimento da bactéria. A
maior parte das proteínas extracelulares produzidas por X. fastidiosa são
proteínas ácidas e de massa molecular aparente entre 20-60 kDa. X. fastidiosa
não sintetizou moléculas de lactonas de homoserina aciladas (LHAs)
reconhecidas pelo sistema repórter utilizado, mas sintetizou uma molécula
extracelular em meio de cultivo, semelhante ao DSF produzido por
X. campestris pv. campestris, capaz de restaurar a atividade da endoglucanase
através do sistema repórter utilizado. A concentração desta molécula em meio
PW modificado foi dependente da densidade de células de X. fastidiosa no
meio.
Título em inglês
Analyses of the extracellular proteomes and accumulation of signal molecules during Xylella fastidiosa 9a5c growth in vitro.
Palavras-chave em inglês
vector insects
citrus variegated chlorosis
gel electrophoresis
growth in vitro
phytopatogenic bacteria
proteins
Resumo em inglês
The bacterium Xylella fastidiosa is the causal agent of the citrus variegated
chlorosis (CVC) and is responsible for significant economic losses in citriculture. The
genome of X. fastidiosa has been completely sequenced and revealed several genes
probably involved in pathogenicity/virulence. Since CVC symptoms are develop a long
time after infection of plant by the bacterium and the severity of the disease has been
associated with high temperatures, its possible that the expression of
pathogenicity/virulence factors is dependent on cellular density and/or temperature
stresses. Thus, the growth of X. fastidiosa in modified liquid PW medium was measured
based on the absorbance of suspensions at (A600), number of colony-forming units
(CFU) and cellular viability, during 16 days at 28 and 32ºC. Extracellular proteins were
extracted and analysed by two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE). Bioassays
were used to determine whether X. fastidiosa produces signal molecules involved in
quorum perception. The results showed that temperatures of 28 and 32ºC did not affect
the growth of the bacterium, based on A600. Temperatures of 28 and 32ºC, incubation
times and the interaction of both factors affected bacterial growth based on CFU
numbers and the cellular viability. X. fastidiosa produced higher number of extracellular
proteins at 32 than at 28ºC, showing that protein secretion is dependent on growth temperature. Several extracellular proteins produced by X. fastidiosa at 28 and 32ºC
were modulated the bacterial growth. Most of the extracellular proteins produced by
X. fastidiosa were acidic with apparent molecular mass within 20-60 kDa. X. fastidiosa
did not synthesize N-acyl homoserine lactone (AHL) recognizes by the reporter system
used. However, it synthesized an extracellular molecule in modified PW medium, similar
to DSF produced by X. campestris pv. campestris, which is able to restore
endoglucanase activity by the reporter system. The concentration of this extracellular
molecule produced by X. fastidiosa was dependent on cellular density.
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Data de Publicação
2004-09-22