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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.11.2021.tde-16062021-123425
Document
Author
Full name
Bruno Augusto Prohmann Tschoeke
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Piracicaba, 2020
Supervisor
Committee
Verdi, Maria Carolina Quecine (President)
Andreote, Fernando Dini
Arisi, Ana Carolina Maisonnave
Silva, Luciana Duque
Title in Portuguese
Aplicação da proteômica e metabolômica no entendimento da interação de Austropuccinia psidii durante o processo de infecção de Eucalyptus grandis e Syzygium jambos
Keywords in Portuguese
A. psidii
E. grandis
S. jambos
Interação patógeno-planta
Metabolômica
Proteômica
Abstract in Portuguese
Os fungos causadores da doença conhecida como ferrugem são um dos grupos mais específicos de patógenos obrigatórios em plantas. Austropuccinia psidii (syn. Puccinia psidii, Sphaerophragmiaceae, Pucciniales) é um fungo Basidiomiceto que alcançou uma grande ocorrência de doença conhecida como ferrugem das Mirtáceas em diversas partes do mundo, causando doença em aproximadamente em 73 gêneros e 460 espécies de Myrtaceae. No Brasil, o patógeno foi inicialmente detectado infectando goiabeiras (Psidium guajava) e posteriormente foi detectado em eucalipto (Eucalyptus grandis). Syzygium jambos também é da família das Mirtáceas, e pode ser infectado com A. psidii. Infecções por A. psidii são frequentemente observadas a partir de urediniósporos assexuados, que podem percorrer grandes distancias devido à ação do vento ou chuva. Sendo os urenidiósporos, a primeira estrutura fúngica com um qual o hospeiro tem contato, o seu perfil proteico é de suma importância para a melhor compreensão do arsenal molecular associado ao estágio inicial de infecção desse patógeno de acordo com os hospedeiros de origem. Diante disso, estudos ômicos se tornam importantes técnicas para aplicar durante o processo de infecção entre A. psidii - E. grandis, visando avaliar quais os compostos estão presentes nessa complexa interação planta-patógeno. Capítulo 1: Inicialmente foi realizado um ensaio in vitro visando avaliar a germinação de urediniósporos de MF-01 e GM-J1, provenientes de E. grandis e S. jambos respectivamente, mediante estimulo do meio ágar-água e em meio ágar-água + 0,5% de óleo mineral. A partir do estudo in vitro foi possível observar que o estimulo óleo mineral (0,5%) apresentou melhores resultados quanto à germinação dos urediniosporos, chegando a 52,6% de germinação em MF- 01 e 17,9% em GM-J1 respectivamente. Os urediniósporos MF-01 e GM-J1 também foram avaliados quanto ao perfil de proteínas visando o melhor entendimento do arsenal de proteínas inicial presentes nesta importante estrutura de infecção. Para tanto, a proteômica foi realizada por meio do espectrômetro de massas LTQ Orbitrap Velos acoplados a um instrumento NLC de LC (MS-MS / MS) por um sistema EASY. Foi possível identificar 819 proteínas totais (incluindo comuns e exclusivas) a partir da análise de urediniósporos MF-01, sendo 74 que mais contribuíram para as diferenças de abundância; e, 798 proteínas totais (incluindo comuns e exclusivas) em urediniósporos GM-J1, sendo 65 que mais contribuíram para as diferenças de abundância. As proteínas diferencialmente abundantes foram identificadas a partir da análise VIP pelo programa Metaboanalyst. Dentre as que mais contribuíram para as diferenças de abundância, as proteínas serina / treonina-proteína fosfatase, aspartato aminotransferase e sacaropina desidrogenase merecem destaque em urediniósporos de MF-01. Enquanto proteínas como proteínas difosfomevalonato descarboxilase, GMP sintase e adenilosuccinato sintetase foram classicadas como as que mais contribuíram para as diferenças de abundância e associadas à urediniósporos de GM-J1. Essas proteínas selecionadas são importantes nos processos iniciais de infecção do patógeno em plantas suscetíveis e pertencentes às rotas metabólitas importantes, podendo ser um indicativo para a produção de uma droga antifúngica, o combate ao patógeno em estágios iniciais da doença. Capítulo 2: Urediniósporos de GM-J1 foram inoculados em plantas suscetíveis de S. jambos, folhas foram coletadas às 0, 72, 144 e 336 horas após a inoculação, e a partir daí foi realizado o monitoramento, por qPCR, do patógeno na planta. Foi possível observar que às 336 h.a.i a quantidade (pg) de DNA de GM-J1 estava maior em relação aos outros tempos amostrados. A partir da análise realizada em espectrômetro de massas Q-Tof PREMIER acoplado a um instrumento RP-nano UPLC foi realizado um estudo proteômico durante o processo de infecção (0, 144 e 336 h.a.i) de GM-J1 em plantas suscetíveis de S. jambos. Foi possível identificar 11 proteínas totais associadas à GM-J1, sendo 9 (0 h.a.i); 7 (144 h.a.i) e 6 (336 h.a.i). Destas, 3 (0 h.a.i); 3 (144 h.a.i) e 1 (336 h.a.i) foram as que mais contribuíram para as diferenças de abundância. Foi possível identificar também 118 proteínas totais associadas à S. jambos, sendo: 87 (0 h.a.i); 69 (144 h.a.i) e 63 (336 h.a.i). Destas, 36 (0 h.a.i); 11 (144 h.a.i) e 11 (336 h.a.i) foram as que mais contribuíram para as diferenças de abundância. As proteínas que mais contribuíram para as diferenças de abundância foram identificadas a partir da análise VIP. Como destaque em cada tempo avaliado, em relação à função da proteína associada a GM-J1, foi possível observar que a proteína glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (0 h.a.i), pode ter um papel importante para a germinação de urediniósporos; glycine dehydrogenase e heat shock protein SSB (144 h.a.i), associados ao crescimento do micélio e patogeniciade; e heat shock protein 60 (336 h.a.i), envolvida em ações relacionada à colonização, infecção e patogenicidade do fungo. Foram também identificadas proteínas importantes no processo de defesa da planta contra o ataque do patógeno: photosystem II protein D2 e photosystem I reaction center subunit III (0 h.a.i); pathogenesis-related protein STH-2-like e translationally-controlled tumor protein homolog (144 h.a.i); major allergen Pru ar 1 e plastocyanin (336 h.a.i). Estes resultados podem indicar que a partir das proteínas encontradas no estudo podemos ter um melhor entendimento acerca do que ocorre durante o processo de infecção na interação A. psidii - S. jambos. Capítulo 3: Foi realizado a análise metabolômica por meio de Cromatografia Líquida (LC-MS; nos modos negativo e positivo de operação) e Cromatografia Gasosa (GC-MS), aliados a uma análise proteômica realizada com o auxílio de espectrômetro de massas LTQ Orbitrap Velos acoplados a um instrumento NLC de LC (MS-MS / MS) por um sistema EASY. Estas análises foram realizadas durante o início e final do processo de infecção de A. psidii em E. grandis, sendo coletado material vegetal inoculado com o patógeno às 0 e 144 horas após a inoculação (h.a.i.). Como resultados foram identificadas 2299 proteínas totais durante a interação planta patógeno. Onde 143 estão associadas a funções de A. psidii e 2156 relacionadas à E. grandis. Dentre as proteínas associadas à A. psidii destacam-se: Fungal Zn binuclear cluster domain conteining protein (0 h.a.i) - associada à formação de apressório; transaldolase (144 h.a.i) e adenosylhomocysteinase (144 h.a.i) - estas associadas ao metabolismo, patogenicidade e colonização no hospedeiro. Em relação as proteínas identificadas em E. grandis, as proteínas que possuem funções interessantes são: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase e rubisco accumulation factor 1 identificadas às 0 h.a.i (participando na produção de energia - fotossíntese); e as proteínas malate dehydrogenase, major allergen Pru av 1-like, abscisic stress ripening protein, actin-7, V-type proton ATPase, proteasome subunit alpha e isoflavone reductase-like identificadas às 144 h.a.i (com funções relacionada à defesa da planta). De acordo com os resultados obtidos a partir das análises metabolômicas foi possível observar que 59 metabólitos foram identificados a partir de LC-MS (50 no modo positivo de operação - 16 às 0 h.a.i e 34 às 144 h.a.i; e 9 no modo negativo de operação - 4 às 0 h.a.i e 5 às 144 h.a.i) e 32 a partir do estudo de GC-MS (com 7 às 0 h.a.i; 24 às 144 h.a.i e 1 presente em ambos os tempos analisados). A partir da análise LC-MS (modo positivo) a oleacin (0 h.a.i) pode estar auxiliando o processo de germinação do fungo. Enquanto a ceramide (144 h.a.i) atua no processo de defesa da planta. Na LC-MS (modo negativo de operação) os metabólitos 6-Hydroxy-3,3',4',5,7,8- hexamethoxyflavone (0 h.a.i) e Chlorhexidine (144 h.a.i) foram encontrados e podem participar do mecanismo de defesa da planta. Como metabólitos importantes na interação patógeno-planta provenientes de GC-MS, o ácido cinâmico (encontrado as 0 h.a.i) pode auxiliar o fungo no processo de entrada nos tecidos da planta; e os metabólitos Calistegina A3, ácido azeláico, ácido glicérico e piridoxamina (encontrados às 144 h.a.i) estão associados ao processo de defesa da planta. Diversas proteínas e metabólitos identificados no presente estudo possuem funções relacionadas ao sistema de defesa da planta ou ao mecanismo de ataque desenvolvido pelo fungo. Há uma correlação entre as proteínas XP_010028896.1 (eukaryotic peptide chain release factor subunit 1-3), XP_010056880.1 (urease accessory protein G), XP_010062321.1 (expansin-A13), XP_010066331.1 (ubiquitin domain-containing protein DSK2a isoform X1), XP_010044210.1 (phosphoglucomutase cytoplasmic isoform X2), XP_010038186.1 (glutathione S-transferase F13) identificadas em E. grandis com a proteína evm.model.NODE_10888_length_9735_cov_3.75075.1 (ADP-ribosylation fator) encontrada no estudo proteômico em A. psidii. Neste sentido, os resultados obtidos contribuem com o melhor entendimento à nível molecular da interação entre A. psidii e E. grandis, servindo como base para futuros estudos. Desta forma, foi possível observar que estudos proteômicos e metabolômicos são de grande importância para um melhor entendimento da doença causada por A. psidii em plantas de E. grandis e S. jambos.
Title in English
Application of proteomics and metabolomics studies to understand the interaction of Austropuccinia psidii during the infection process in Eucalyptus grandis and Syzygium jambos
Keywords in English
A. psidii
E. grandis
S. jambos
Metabolomics
Pathogen-plant interaction
Proteomics
Abstract in English
The fungi that cause the disease known as rust are one of the most specific groups of pathogens required in plants. Austropuccinia psidii (syn. Puccinia psidii, Sphaerophragmiaceae, Pucciniales) is a Basidiomycete fungus that has reached a large occurrence of a disease known as Mirtacea rust in various parts of the world, causing disease in approximately 73 genera and 460 species of Myrtaceae. In Brazil, the pathogen was initially detected by infecting guava trees (Psidium guajava) and was later detected in eucalyptus (Eucalyptus grandis). Syzygium jambos is also in the Mirtaceae family, and can be infected with A. psidii. A. psidii infections are often seen from asexual urediniospores, which can travel great distances due to the action of wind or rain. Since urenidiospores are the first fungal structure with which the hospeiro has contact, their protein profile is of paramount importance for a better understanding of the molecular arsenal associated with the initial stage of infection of this pathogen according to the host of origin. Therefore, omic studies become important techniques to apply during the infection process between A. psidii - E. grandis, aiming to evaluate which compounds are present in this complex plant-pathogen interaction. Chapter 1: Initially, an in vitro test was carried out to evaluate the germination of MF-01 and GM-J1 uredinospores, from E. grandis and S. jambos respectively, by stimulating the agar-water medium and agar-water medium + 0.5% mineral oil. From the in vitro study it was possible to observe that the mineral oil stimulus (0.5%) showed better results regarding the germination of the urediniospores, reaching 52.6% of germination in MF-01 and 17.9% in GM-J1 respectively. The urediniospores MF-01 and GM-J1 were also evaluated for protein profile in order to better understand the initial protein arsenal present in this important infection structure. For this purpose, proteomics was performed using the LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer coupled to an LC NLC instrument (MS-MS / MS) by an EASY system. It was possible to identify 819 total proteins (including common and exclusive) from the analysis of MF-01 urediniospores, 74 of which contributed most to differences in abundance; and, 798 total proteins (including common and exclusive) in urediniospores GM-J1, 65 of which contributed most to differences in abundance. Dierentially abundant proteins were identified from the VIP analysis by the Metaboanalyst program. Among those that most contributed to the differences in abundance, the proteins serine / threonine-protein phosphatase, aspartate aminotransferase and sucropine dehydrogenase deserve to be highlighted in MF-01 urediniospores. While proteins such as diphosphomevalonate decarboxylase proteins, GMP synthase and adenyl succinate synthase were classified as those that most contributed to the differences in abundance and associated with GM-J1 urediniospores. These selected proteins are important in the initial pathogen infection processes in susceptible plants and belonging to important metabolic routes, and may be indicative for the production of an antifungal drug, the fight against the pathogen in the early stages of the disease. Chapter 2: GM-J1 urediniospores were inoculated into susceptible plants of S. jambos, leaves were collected at 0, 72, 144 and 336 hours after inoculation, and from there, the pathogen was monitored by qPCR in the plant. It was possible to observe that at 336 h.a.i the amount (pg) of GM-J1 DNA was greater in relation to the other sampled times. From the analysis performed on a Q-Tof PREMIER mass spectrometer coupled to an RP-nano UPLC instrument, a proteomic study was carried out during the infection process (0, 144 and 336 hai) of GM-J1 in susceptible plants of S. jambos. It was possible to identify 11 total proteins associated with GM-J1, 9 (0 h.a.i); 7 (144 h.a.i) and 6 (336 h.a.i). Of these, 3 (0 h.a.i); 3 (144 h.a.i) and 1 (336 h.a.i) were the ones that most contributed to the differences in abundance. It was also possible to identify 118 total proteins associated with S. jambos, being: 87 (0 h.a.i); 69 (144 a.i.) and 63 (336 a.i.). Of these, 36 (0 h.a.i); 11 (144 h.a.i) and 11 (336 h.a.i) contributed the most to differences in abundance. The proteins that most contributed to the differences in abundance were identified from the VIP analysis. As a highlight in each evaluated time, in relation to the function of the protein associated with GM-J1, it was possible to observe that the protein glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (0 h.a.i), may have an important role for the germination of urediniospores; glycine dehydrogenase and heat shock protein SSB (144 h.a.i), associated with mycelial growth and pathogenesis; and heat shock protein 60 (336 h.a.i), involved in actions related to colonization, infection and pathogenicity of the fungus. Important proteins were also identified in the plant's defense process against pathogen attack: photosystem II protein D2 and photosystem I reaction center subunit III (0 h.a.i); pathogenesis-related protein STH-2-like and translationally-controlled tumor protein homolog (144 h.a.i); major allergen Pru ar 1 and plastocyanin (336 h.a.i). These results may indicate that based on the proteins found in the study, we can have a better understanding of what happens during the infection process in the interaction A. psidii - S. jambos. Chapter 3: Metabolomic analysis was performed using Liquid Chromatography (LC-MS; in the negative and positive modes of operation) and Gas Chromatography (GC-MS), combined with a proteomic analysis performed with the aid of an LTQ Orbitrap mass spectrometer Velos coupled to an LC NLC instrument (MS-MS / MS) by an EASY system. These analyzes were performed during the beginning and end of the A. psidii infection process in E. grandis, and plant material inoculated with the pathogen was collected at 0 and 144 hours after inoculation (h.a.i.). As a result, 2299 total proteins were identified during the plant pathogen interaction. Where 143 are associated with functions of A. psidii and 2156 related to E. grandis. Among the proteins associated with A. psidii, the following stand out: Fungal Zn binuclear cluster domain conteining protein (0 h.a.i) - associated with the formation of appressorium; transaldolase (144 h.a.i) and adenosylhomocysteinase (144 h.a.i) - these associated with metabolism, pathogenicity and colonization in the host. Regarding the proteins identified in E. grandis, the proteins that have interesting functions are: ribulose bisphosphate carboxylase / oxygenase activase and rubisco accumulation factor 1 identified at 0 h.a.i (participating in the production of energy - photosynthesis); and malate dehydrogenase proteins, major allergen Pru av 1-like, abscisic stress ripening protein, actin-7, V-type proton ATPase, proteasome subunit alpha and isoflavone reductase-like identified at 144 hai (with functions related to plant defense). According to the results obtained from the metabolomic analyzes it was possible to observe that 59 metabolites were identified from LC-MS (50 in the positive mode of operation - 16 at 0 hai and 34 at 144 hai; and 9 in the negative mode of operation - 4 at 0 hai and 5 at 144 hai) and 32 from the study of GC-MS (with 7 at 0 hai; 24 at 144 hai and 1 present in both times analyzed). From the LC-MS analysis (positive mode), oleacin (0 h.a.i) may be helping the fungus germination process. While ceramide (144 h.a.i) acts in the plant defense process. In LC-MS (negative mode of operation) the metabolites 6-Hydroxy-3,3 ', 4', 5,7,8-hexamethoxyflavone (0 hai) and Chlorhexidine (144 hai) were found and may participate in the defense mechanism of the plant. As important metabolites in the pathogen-plant interaction from GC-MS, cinnamic acid (found at 0 h.a.i) can assist the fungus in the process of entering the plant tissues; and the metabolites Calistegina A3, azelaic acid, glycolic acid and pyridoxamine (found at 144 h.i.i) are associated with the plant's defense process. Several proteins and metabolites identified in the present study have functions related to the plant's defense system or the attack mechanism developed by the fungus. There is a correlation between proteins XP_010028896.1 (eukaryotic peptide chain release factor subunit 1-3), XP_010056880.1 (urease accessory protein G), XP_010062321.1 (expansin-A13), XP_010066331.1 (ubiquitin domain-containing protein DSK2a isoform X1), XP_010044210.1 (cytoplasmic phosphoglucomutase isoform X2), XP_010038186.1 (glutathione S-transferase F13) identified in E. grandis with the protein evm.model.NODE_10888_length_9735_cov_3.75075.1 (ADP-ribosyl factor) A. psidii. In this sense, the results obtained contribute to a better understanding at the molecular level of the interaction between A. psidii and E. grandis, serving as a basis for future studies. Thus, it was possible to observe that proteomic and metabolomic studies are of great importance for a better understanding of the disease caused by A. psidii in plants of E. grandis and S. jambos.
 
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Publishing Date
2021-06-18
 
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