Ribosomal DNA (45S rDNA) is one of the most well-characterized tandem arrays, formed by a cluster of 18S-5.8S-26S genes and also ITS (internal transcribed spacer) and ETS (external transcribed spacer). In mitotic chromosomes, it is possible to distinguish secondary constriction as a manifestation of a subset of 45S rDNA motifs with active transcription due to RNA polymerase I persistence. Each active motif encodes an 18S, 5.8S, and 26S rRNA transcript. As a result of the ribosomal gene expression and processing and the association with polypeptides, a nuclear structure called a nucleolus is formed. Consequently, there is a relationship between the 45S rDNA transcription and the organization of the nucleolus. The literature has reported the differential expression of secondary constrictions between homologous chromosomes, observing the heteromorphism in the size and intensity of the 45S rDNA. As a result, it was hypothesized that the heteromorphism/homomorphism of the 45S rDNA could occur to different degrees, affecting the nucleolar morphology. In this study, inbred families of maize (JD 1-3, JD 2-1, JD 4-1, and JD 4-4) and their hybrids were analyzed. Qualitative characterization was performed using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with 45S rDNA probes and fibrillarin immunodetection to describe the secondary constriction in chromosome 6 and in the nucleus of binucleolar cells during the initial interphase. Measurements were made by image analysis, and the data were analyzed using mixed models and multivariate and univariate statistics. The results did not report homomorphism itself; on the contrary, heteromorphism was observed for both the 45S rDNA and the nucleolus in the inbred lines and hybrids. The heteromorphism cases were quantitatively subdivided into three categories according to the value of the indexes of the variables and the heatmap, as slightly, significantly, and notoriously heteromorphic. FISH analyzes have shown that ribosomal DNA varies independently of the mitotic phase. In addition, inbred lines of the families JD 4-4 (3), JD 2-1 (2), JD 4-1 (1) were the most heteromorphic, while the JD 1-3 inbred lines showed lower values, close to the homomorphism. Five different inbred lines of the JD 4-4 family were discriminated as parents of heteromorphic hybrids based on the marking signals for the rDNA 45S probe. The nucleolus analyzes showed heteromorphism in inbred and hybrid lines, mainly involving lines of the JD family 4-4. No structural difference was observed between inbred lines and hybrids. However, the correlation of the results of the 45S rDNA expression with the nucleolar morphology, it was possible to group all genotypes in clusters, observing a slight variation in the degree of heteromorphism of the 45S rDNA between the clusters. At the same time, the structuring of the nucleolus had a homogeneous behavior between them. The heteromorphism in the 45S rDNA can be explained because the rDNA sites may be subject to a higher rate of unequal recombination, which may cause variation in gene copy number. This results in possible epigenetic inactivation mechanisms that could be involved in the control of the ribosomal gene expression.

O DNA ribossomal (rDNA de 45S) é um dos arranjos in tandem mais bem caracterizados, formado por um cistron de genes 18S-5.8S-26S e também ITS (internal transcribed spacer) e ETS (external transcribed spacer). Nos cromossomos mitóticos é possível distinguir a constrição secundária como uma manifestação de um subconjunto de motivos do rDNA de 45S com transcrição ativa em virtude da persistência da RNA Polimerase I. Cada gene ativo codifica um transcrito de RNA de 18S, 5.8S e 26S. Como resultado da expressão e processamento dos genes ribossomais e sua associação com polipeptídeos, forma-se uma estrutura nuclear denominada nucléolo. Consequentemente existe uma relação entre a transcrição do rDNA de 45S e a organização do nucléolo. A literatura tem relatado a expressão diferencial da constrição secundária entre os cromossomos homólogos tanto no tamanho quanto na intensidade do heteromorfismo do rDNA de 45S. Em função disso, foi hipotetizado que o heteromorfismo/homomorfismo do rDNA de 45S pode ocorrer em diferentes graus, influenciando a morfologia nucleolar. Neste estudo, famílias de linhagens de milho (JD 1-3, JD 2-1, JD 4-1 e JD 4-4) e seus híbridos foram analisadas. A caracterização qualitativa por hibridização molecular in situ fluorescente (FISH) com sondas rDNA de 45S e imunodetecção de fibrilarina, para descrever a constrição secundária no cromossomo 6 e no nucléolo de células binucleolares do início da interfase, respectivamente. A análise quantititativa dos parâmetros foi realizada por análise de imagem e os dados foram analisados utilizando-se modelos mistos e estatísticas multivariadas e univariadas. Os resultados não reportaram homomorfismo propriamente dito, ao contrário, foi observado heteromorfismo tanto para o rDNA de 45S quanto para o nucléolo, nas linhagens e híbridos analisados. Os casos de heteromorfismos foram subdividos quantitativamente em 3 categorias de acordo com o valor dos índices das variáveis e do heatmap, sendo considerado como levemente, significativamente e notoriamente heteromórifco. As análises de FISH demonstraram que o DNA ribossomal varia independentemente da fase do ciclo celular. Além disso, as linhagens da família JD 4-4 (3), JD 2-1 (2), JD 4-1 (1) foram as mais heteromórficas, enquanto as linhagens JD 1-3 apresentaram valores menores, próximos ao homomorfismo. Cinco linhagens da família JD 4-4 foram discriminadas como parentais de híbridos heteromórficos com base nos sinais de marcação para a sonda de rDNA 45S. As análises de nucléolo mostraram heteromorfismo em linhagens endogâmicas e nos híbridos, envolvendo principalmente linhagens da família JD 4-4. Assumindo linhagens irmãs e híbridos como dois tipos de material em estudo, não foi observada diferença estrutural entre eles. Porém, a partir da correlação dos resultados da expressão do rDNA de 45S com a morfologia nucleolar foi possível agrupar todos os genótipos em clusters, observando que existe uma leve variação no grau de heteromorfismo do rDNA de 45S entre os clusters, enquanto a estruturação do nucléolo teve um comportamento homogêneo entre eles. O heteromorfismo do rDNA de 45S pode ser explicado porque os sítios de rDNA podem estar sujeitos a uma maior taxa de recombinação desigual, podendo causar variação no número de cópias do gene. Isso porque há mecanismos de inativação epigenética que poderiam estar envolvidos no controle de expressão dos genes ribossomais.