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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.11.2014.tde-11112014-142109
Documento
Autor
Nome completo
Alessandra Carolina Palhares
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 2014
Orientador
Banca examinadora
Vieira, Maria Lucia Carneiro (Presidente)
Santos, Renato Vicentini dos
Amorim, Lilian
Margarido, Gabriel Rodrigues Alves
Rossi, Maria Magdalena
Título em português
Análise, via RNAseq, do transcritoma da cana-de-açúcar e identificação de genes expressos em resposta a Sporisorium scitamineum, o agente causal do carvão
Palavras-chave em português
Sporisorium scitamineum
Cana-de-açúcar
Expressão diferencial de genes
Interação planta-patógeno
RNAseq
Transcriptoma
Resumo em português
A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma importante cultura agrícola, sendo hospedeira de vários patógenos, incluindo o fungo biotrófico Sporisorium scitamineum, agente causal do carvão. A doença reduz a produtividade das lavouras de cana e a qualidade de seus produtos, sendo reconhecida pelo desenvolvimento de uma estrutura em forma de chicote, onde os teliósporos são produzidos. O objetivo deste estudo foi analisar o transcritoma da interação cana-de-açúcar - S. scitamineum, visando a identificação de genes do hospedeiro diferencialmente expressos em resposta à infecção fúngica. Gemas da variedade tolerante 'RB92-5345' foram inoculadas com S. scitamineum e mantidas em casa de vegetação para a coleta das amostras, em dois momentos: 120 h após a inoculação, e no momento da emissão do chicote, aos 200 dias após a inoculação. Foram construídas 12 bibliotecas com base na abordagem RNAseq. Três estratégias computacionais foram utilizadas nas etapas de mapeamento e análise da expressão diferencial de genes da cana: (i) STAR e DESeq, tomando como referência o genoma do sorgo; (ii) Bowtie 2 e DESeq, e (iii) CLC Genomics Workbench, tomando como referência as sequências codificadoras (CDS) do sorgo. Diagramas de Venn foram construídos para identificar genes diferencialmente expressos comuns às três estratégias computacionais, aumentando a acurácia das análises. Para a anotação, foi usada a ferramenta BLAST2GO. Foram obtidos 225 milhões de reads; dentre os 185 milhões usados no mapeamento, 66% foram mapeados em genes e 51% nas CDS. Aproximadamente 77% dos genes e 87% das CDS mapeados apresentaram atividade transcricional (pelo menos um read mapeado), sob as condições do experimento, em ambos os momentos da interação. Um total de 596 e 2.148 genes diferencialmente expressos foram identificados nas respostas iniciais e tardias à infecção, respectivamente; para 79% deles foi possível atribuir uma função. Pelas intersecções, 41 (resposta inicial) e 206 (resposta tardia) genes foram comuns às três estratégias. Sugere-se que a planta percebe o patógeno no início da interação, porém o fungo é capaz de suprimir a resposta de defesa vegetal. Propõe-se que há uma reprogramação da expressão gênica defesa-orientada, favorecendo o desenvolvimento da planta, mesmo com a doença instalada. A expressão de genes relacionados à resistência, às vias de hormônios e com a formação da parede celular (além de inibidores de proteínas fúngicas) sugerem que a planta se empenha drasticamente para sobreviver após 200 dias de interação. Decifrando os perfis do transcritoma da cana na interação com S. scitamineum, este trabalho deve contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos de resistência ao carvão.
Título em inglês
RNAseq based transcriptome analysis and identification of sugarcane genes expressed in response to Sporisorium scitamineum, the causal agent of smut
Palavras-chave em inglês
Sporisorium scitamineum
Differential gene expression
Plant pathogen interaction
RNAseq
Sugarcane
Transcriptome
Resumo em inglês
Sugarcane (Saccharum spp.) is an important crop, and hosts several pathogens, including the biotrophic fungus Sporisorium scitamineum, the causal agent of smut. The disease reduces the sugarcane crop yield and the quality of its products, and is recognized by the development of a whip-like structure, where teliospores are produced. The objective of this study was to analyze the transcriptome of sugarcane - S. scitamineum interaction and to identify differentially expressed genes from the host in response to fungal infection. Buds of the tolerant variety 'RB92-5345' were inoculated with S. scitamineum and maintained in a greenhouse for two sampling interaction moments: 120 h after inoculation, and at the moment of the whip emission, 200 days after inoculation. Twelve libraries were constructed based on RNAseq approach. Three computational strategies were used in the mapping step and differential expression analysis of sugarcane genes: (i) STAR and DESeq, using as reference the sorghum genome; (ii) Bowtie 2 and DESeq, and (iii) CLC Genomics Workbench, using as reference the coding sequences (CDS) from sorghum. Venn diagrams were created to identify differential expressed genes that were common to the three computational strategies, thus increasing the analysis accuracy. For annotation, the BLAST2GO tool was used. We have obtained 225 million reads; out of the 185 million reads used for mapping, 66% were mapped to genes and 51% to CDS. Approximately 77% and 87% of the mapped genes and CDS respectively showed transcriptional activity (at least one read was mapped) under the experimental conditions at both interaction moments. A total of 596 and 2,148 differentially expressed genes were identified at early and late responses to the infection, respectively; it was possible to attribute function to 79% of them. Through intersectioning, 41 (early response) and 206 (late response) genes were found to be common to the three strategies. It is suggested that the plant recognizes the pathogen at the beginning of interaction period, though the fungal is able to suppress the host defense response. It is also proposed that a defense-oriented transcriptional reprogramming takes place, supporting plant development even with the disease setting. The expression of genes related to resistance, hormone pathways, and cell wall formation (as well as inhibitors of fungal proteins) suggests that the plant makes exceptional efforts to survive after 200 days of interaction. Deciphering the sugarcane transcriptome profile during the interaction with S. scitamineum, this study should contribute to a better understanding of the resistance mechanisms to the smut.
 
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Data de Publicação
2014-11-26
 
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