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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.11.2020.tde-01122020-224750
Documento
Autor
Nombre completo
Líllian Beatriz Januario Bibiano
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Piracicaba, 2020
Director
Tribunal
Camargo, Luis Eduardo Aranha (Presidente)
Mituti, Tatiana
Sakate, Renate Krause
Título en portugués
Caracterização dos mecanismos de defesa do acesso PI414723 de Cucumis melo L. ao Zucchini yellow mosaic virus e seleção de candidatos a genes de resistência no locus Zym-1
Palabras clave en portugués
Genes R
Melão
Melhoramento genético
Quantificação viral
ZYMV
Resumen en portugués
O zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) é um patógeno que apresenta elevado potencial de dano para a cultura do meloeiro. O controle genético desse vírus é a forma mais eficiente de manejo e o acesso PI414723 é a única fonte de resistência efetivamente utilizada em programas de melhoramento. Sua resistência é controlada ao menos por um locus dominante, denominado Zym-1. Este estudo objetivou: i: caracterizar o mecanismo de resistência de PI414723 ao ZYMV relacionado à infecção, multiplicação e/ou invasão sistêmica viral e ii: selecionar genes candidatos de resistência no locus Zym-1 utilizando as informações de mapas genéticos de meloeiro associados à sequência do genoma de Cucumis melo e quantificar os níveis de expressão dos genes selecionados. Para tanto, uma metodologia de quantificação absoluta do ZYMV por PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) foi desenvolvida a fim de comparar o número de partículas virais entre os genótipos resistente PI414723 (PI) e suscetível 'Védrantais' (Ved). Para caracterizar a resistência em PI, o vírus foi inoculado na metade dos cotilédones de ambos os genótipos, os quais foram divididos em regiões inoculadas (I) e não inoculadas (NI). O vírus foi quantificado nessas regiões e foi realizada a recuperação biológica de partículas virais aos 3, 7 e 10 dias após a inoculação (dai) e em folhas apicais aos 10 dai. Ainda, foi avaliado se o mecanismo de resistência envolve uma reação de hipersensibilidade (RH) no ponto de inoculação assim como ativação da resistência sistêmica adquirida (RSA), através da análise da expressão de genes que codificam proteínas PR. Em todos os tempos e tecidos analisados, os títulos virais foram maiores em Ved em comparação à PI. O vírus não foi detectado em folhas apicais de PI, mas o foi em alto título em Ved aos 10 dai. Foi observada a formação de RH em cotilédones de PI às 12 e 24 horas após a inoculação, e o mesmo não foi observado em cotilédones de Ved. Os genes PR1 e PR4 foram positivamente regulados somente em PI após a inoculação. Tomados em conjunto, os resultados mostram que o vírus infecta e se multiplica em ambos os genótipos, mas não invade PI sistemicamente. Além disto, ocorre ativação da RSA no genótipo resistente e o vírus fica restrito ao ponto de inoculação devido ao mecanismo de RH. Em relação à escolha de candidatos no locus Zym-1, 13 genes foram selecionados no cromossomo 2 com base em seus domínios funcionais envolvidos na resistência ao vírus. A expressão dos candidatos foi analisada em cotilédones às 12 e 24 horas após a inoculação (hai) e o vírus foi quantificado nesses tempos e aos 7 dias após a inoculação (dai). O título viral não variou entre os genótipos às 12 hai, mas foi maior em Ved às 24 hai. Dois genes foram positivamente regulados às 12 hai em PI, os quais correspondem a cópias do gene RTM2 (restricted TEV movement 2), responsável por restringir o movimento de vírus a longa distância. Ja às 24 hai, dois análogos de genes de resistência (RGA) foram negativamente regulados em Ved. Um desses RGAs codifica uma proteína CC-NB-LRR com domínio adicional Rx-like de reconhecimento de vírus e este foi positivamente regulado em PI. Portanto, mecanismos de defesa distintos são ativados no genótipo PI414723 em resposta à infecção pelo ZYMV, resultando na resistência à invasão sistêmica viral.
Título en inglés
Characterization of defense mechanisms of PI414723 accession from Cucumis melo L. to the Zucchini yellow mosaic virus and selection of resistance candidate genes at the Zym-1 locus
Palabras clave en inglés
Melon
Plant breeding
R genes
Virus quantification
ZYMV
Resumen en inglés
The zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) is a pathogen that is able to severely reduce the yield of melon plants. The use of genetic control is the most efficient way of management for this virus, and the PI414723 (PI) melon accession is the only source of resistance effectively used in breeding programs. The PI resistance is controlled by at least a dominant locus called Zym-1. The objective of this study was: i: to characterize the mechanism of PI414723 resistance to ZYMV related to infection, multiplication and/or systemic viral spread and ii: to select resistance candidate genes at the Zym-1 locus using the information from genetic maps associated with the genome sequence of Cucumis melo, and then quantify the expression levels of the selected genes. Therefore, a methodology for absolute quantification of ZYMV by quantitative real-time PCR (RT-qPCR) was developed to compare the number of viral particles between the resistant PI and susceptible 'Védrantais' (Ved) genotypes. To characterize the resistance in PI, the virus was inoculated into one half of the cotyledons of both genotypes, which were divided into inoculated (I) and non-inoculated (NI) regions. The virus was quantified in these regions and biological recovery of the viral particles was carried out at 3, 7 and 10 days after inoculation (dai) and in apical leaves at 10 dai. Furthermore, it was evaluated whether the resistance mechanism involves a hypersensitive reaction (HR) at the inoculation site as well as activation of the systemic acquired resistance mechanism (SAR), through the analysis of the expression of genes encoding PR proteins. In all evaluation times and analyzed tissues, viral titers were higher in Ved compared to PI. The virus was not detected in PI apical leaves, but it was highly detected in Ved at 10 dai. HR was observed in PI cotyledons at 12 and 24 hours after inoculation, the same was not observed in Ved cotyledons. The PR1 and PR4 genes were up regulated only in PI after inoculation. Taken together, the results show that the virus infects and multiplies in both genotypes but does not invade PI systemically. In addition, the SAR mechanism is activated in the resistant genotype and the virus is restricted to the inoculation site due to HR. Regarding the selection of candidate genes at the Zym-1 locus, 13 genes were selected on chromosome 2 based on their protein domains involved in virus resistance. The expression of the candidate genes was analyzed in cotyledons at 12 and 24 hours after inoculation (hai) and the virus was quantified at these same periods, as well as at 7 days after inoculation (dai). The viral titer did not vary between genotypes at 12 hai, but was higher in Ved at 24 hai. Two genes were up regulated at 12 hai in PI, which are copies of the RTM2 gene (restricted TEV movement 2), responsible for restricting the virus long distance movement. At 24 hai, two resistance gene analogs (RGA) were down regulated in Ved. One of these RGAs encodes a CC-NB-LRR protein with additional virus recognition domain (Rx-like) and has been up regulated in PI. Therefore, distinct mechanisms are activated in PI414723 in response to ZYMV infection, enabling this PI to resist systemic viral spread.
 
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Fecha de Publicación
2020-12-03
 
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