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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.11.2020.tde-01102020-130757
Document
Author
Full name
Sabrina Holz
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Piracicaba, 2020
Supervisor
Committee
Pascholati, Sergio Florentino (President)
Delalibera Junior, Italo
Furtado, Edson Luiz
Godoy, Cláudia Vieira
Title in Portuguese
Potencial de isolados de Metarhizium spp. no controle alternativo da ferrugem-asiática da soja
Keywords in Portuguese
Biocontrole
Controle biológico
Ferrugem-asiática
Fungos entomopatogênicos
Indução de resistência
Soja
Abstract in Portuguese
A produtividade da cultura da soja está em constante ameaça por diversos fatores, incluindo o fungo Phakopsora pachyrhizi, causador da principal doença da soja no Brasil, a ferrugem-asiática. A busca por medidas alternativas como, o controle biológico e a indução de resistência, se fazem necessárias para integrar o sistema de manejo. Assim, os fungos entomopatogênicos do gênero Metarhizium, já estabelecidos no controle biológico de pragas e por apresentarem associação benéfica com as plantas, surgem como potenciais no controle de doenças de plantas. Dessa maneira, objetivou-se avaliar o potencial de três espécies do fungo (M. anisopliae BR-01, M. robertsii BR-02 e M. humberii BR-03) no controle de P. pachyrhizi, em testes in vitro (efeito direto) e in vivo (efeito indireto). Além disso, caracterizaram-se as moléculas biologicamente ativas presentes no filtrado de cultura quanto ao tamanho das moléculas, estabilidade ao calor e resistência a atividade da proteinase K. Os testes in vitro foram realizados em placa de Petri de poliestireno, utilizando o teste da microgota para se avaliar o efeito direto de suspensão de conídios de Metarhizium (2x105 conídios/mL) e do filtrado de cultura livre de estruturas fúngicas (FCLEF) na germinação de urediniósporos. Em ensaios com folíolos destacados de soja, as preparações (conídios e FCLEF) foram pulverizadas 72 horas antes da inoculação (h.a.i.) do fungo causador da ferrugem e avaliou-se o número de pústulas por cm2. Com plantas mantidas em casa de vegetação (cultivar DS 5916 IPRO) foram realizados dois ensaios. No primeiro aplicou-se os conídios de Metarhizium spp. em dois trifólios da planta, 72 h.a.i. do patógeno e no segundo pulverizou-se o filtrado de cultura em dois trifólios da soja e inoculou-se a ferrugem em três trifólios, a fim de se avaliar a possível transloção de algum sinal e a severidade foi avaliada com base em escala diagramática. Em outro experimento, avaliou-se a inoculação do Metarhizium, via solo, como inoculante, utilizando 2 mL da suspensão de 1x108 conídios/mL, pela metodologia "soil drench", e após 20 dias inoculou-se o patógeno na parte aérea e avaliou-se a severidade da doença. Para todos os ensaios, utilizou-se as três espécies de Metarhizium (BR-01, BR-02 e BR-03). Nos resultados dos testes in vitro, apenas os tratamentos com filtrados de culturas de Metarhizium apresentaram inibição, variando o efeito com cada isolado, sendo o destaque para M. robertsii BR-02, com 66% de inibição na menor concentração final (12,5%) e 99% de inibição na maior (50%). Em folíolo destacado utilizando-se suspensões de conídios, M. anisopliae BR-01 e M. humberii BR-03 se destacaram com redução no número de pústulas em relação ao controle água. Para o filtrado de cultura, tanto em folíolo destacado quanto em plantas, o destaque foi para M. humberii BR-03, que reduziu os sintomas de ferrugem nos três trifólios, e no terceiro trifólio que não recebeu os indutores, mostrando redução significativa na severidade quando comparada com o controle água. Para o ensaio utilizando Metarhizium como inoculante, M. anisopliae BR-01 se sobressaiu em relação aos demais, causando redução na severidade da doença em relação ao controle água. Durante estágio na Louisiana State University nos Estados Unidos da América, foram realizados ensaios para a quantificação da biomassa do fungo causador da ferrugem em soja, através de PCR em tempo real, em plantas de soja (Pioneer 93M60) tratadas com filtrados de cultura (isolados M. humberii BR-03, M. anisopliae BR-01 e M. robertsii US-04). Os resultados mostraram-se condizentes quanto a redução de severidade de ferrugem e a expressão relativa do gene alvo de P. pachyrhizi, com os três isolados. Ressalta-se que embora o ensaio tenha ocorrido em condições diferentes das do Brasil, o filtrado de cultura de Metarhizium apresentou efeito contra a ferrugem da soja. Sobre a caracterização dos metabólitos, demonstrou-se que os compostos ativos presentes nos filtrados estão na faixa de 3 a 10 kDa, são estáveis ao calor e, provavelmente, de natureza não proteica. Portanto, conclui-se que os diferentes isolados de Metarhizium apresentam atividade antiferrugem direta e/ou indireta, via possível ativação dos sistemas de defesa das plantas de soja, contra P. pachyrhizi, sendo que os mecanismos de ação devem ser esclarecidos através de análises bioquímicas e moleculares. Finalmente, não há relatos anteriores na literatura científica sobre o uso de Metarhizium para este patossistema, sendo os resultados deste estudo inovadores e com potencial para o controle da ferrugem-asiática da soja.
Title in English
Potential of Metarhizium spp. isolates in the alternative control against Asian soybean rust
Keywords in English
Asian soybean rust
Biocontrol
Biological control
Entomopathogenic fungus
Resistance induction
Soybean
Abstract in English
The production of soybean crop is under constant threat of different fungal pathogens, including Phakopsora pachyrhizi, the causal agent of Asian soybean rust (ASR). Thus, alternative control measures, such as biological control and resistance induction, have been integrated into the management system of this disease. On the other hand, the entomopathogenic fungus Metarhizium sp. is used in the biological control of pests and shows association with plants through endophytic activity or rhizosphere colonization exibiting potential to be used against plant pathogens. Thus, the objective of this work was to evaluate the potential of three diferent species of the fungus (M. anisopliae BR-01, M. robertsii BR-02 and M. humberii BR-03) in the control of soybean rust under in vitro (direct effect) and in vivo (indirect effect) assays. Besides that, the biologically active molecules present in the Metarhizium spp. culture filtrates free of fungal structures (CFFFS) were characterized in terms of molecular weight, heat and proteinase K activity stabilities. The in vitro tests were carried out inside of polystyrene Petri dishes, by using micro drops to evaluate the direct effect of conidial suspensions of Metarhizium (2x105 conidia/mL) and of the CFFFS filtrates in germination of the rust spores. By using detached soybean leaves (kept under laboratory conditions), they were first sprayed by using the preparations (CFFFS filtrates and conidial suspensions) and after 72 h they were spray-inoculated with the rust spores and the number of pustules per cm2 was evaluated. In plants maintained under greenhouse conditions (cultivar DS 5916 IPRO), two experiments were carried out. In the first assay, Metarhizium conidia were sprayed onto two trefoil of the soybean plants and after 72 h they were spray-inoculated with urediniospores suspensions. In the second one, CFFFS filtrates were sprayed onto two trefoil of the plants and later on spray-inoculated with the rust spores in three trefoil, aiming to evaluate a possible signal translocation (systemic resistance) and the severity of the disease was measured by using a diagrammatic scale. In the other experiment, Metarhizium spp. was evaluated via soil inoculation ("soil drench") by adding 2 mL of the spore suspension (1x108 conidia/mL), and after 20 days, a urediniospore suspension was spray-inoculated in two trefoil of the plants and the severity mensured. For all the mentioned experiments, the species Metarhizium (BR-01, BR-02 e BR-03) were used. In the results for the in vitro tests, only the CFFFS filtrate treatments showed inhibition, where the M. robertsii BR-02 was the best one, with inhibition around 66% in the lowest final concentration (12,5%) and around 99% in the highest one (50%). In the detached leaves assays, by using the conidial suspensions, the M. anisopliae BR-01 and M. humberii BR-03 isolates showed the best performance based upon reduction in pustule number. For the CFFFS filtrates both in detached leaves and in whole plants, the M. humberii BR-03 isolate was the best one, by showing a significant reduction in rust symptoms in the three trefoils, and in the third trefoil that did not receive the inducers. In the assay regarding Metarhizium as inoculant via soil, the M. anisopliae BR-01 isolate was the best one in reducing the symtptoms of rust in the plants. During the intership at Louisiana State University - USA, assays were performed to quantify the rust fungal biomass inside soybean leaves by using real time PCR, in soybean plants (Pioneer 93M60) treated with CFFFS filtrates (M. humberii BR-03, M. anisopliae BR-01 and M. robertsii US-04). The results were consistent as well as in reducing the disease severity and the relative expression of the target P. pachyrhizi gene with the three species. Although, the assay was carried out under different conditions from Brazil, the CFFFS filtrates showed anti-rust activity. Regarging to characterization of the biologically active molecules, the active compounds in the CFFFS filtrates are in the range of 3 to 10 kDa, heat stable, and most likely non-protein in nature, mainly for the isolates M. anisopliae US-02 and M. humberii BR-03. Therefore, the conclusion is that different Metarhizium isolates show anti-rust activity (directly and indirectly, probably by induction of resistance in soybean plants) and the mode of action needs to studied through biochemical and molecular approaches. Finally, there are not previous reports in the literature by using Metarhizium for this pathosystem, and the results from this study are novel and have a high potencial for the control of the Asian soybean rust.
 
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Release Date
2022-10-01
Publishing Date
2020-10-07
 
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